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作者：張達屠冠軍韓亞新叢琳梁德勇單位：中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院

動物模型制作與分組：以腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛（0.4mL/100g）麻醉，將大鼠俯臥位固定于實驗臺上。選定T10、T11為正中切口，常規(guī)消毒、鋪巾，沿皮膚、皮下逐層暴露，顯露出T10~T11棘突及椎板并咬除之，暴露硬脊膜。根據(jù)Nystrom法用10g力量動脈夾從兩邊夾住暴露脊髓，造成重復性好的固定壓迫，壓迫時間為5min，用4鄄0號絲線縫合傷口。損傷后每天人工排尿（便）2次，每2d局部消毒1次。模型動物隨機分成4組，每組12只。損傷組：運用Nystrom法造成T10~T11節(jié)段脊髓損傷；米諾環(huán)素組：同法造T10~T11節(jié)段脊髓損傷，受傷1h后用50mg/kg的米諾環(huán)素經(jīng)口灌胃，24h后再次給50mg/kg的米諾環(huán)素經(jīng)口灌胃，然后再予5d的25mg/kg的米諾環(huán)素經(jīng)口灌胃；干細胞移植組：同法造T10~T11節(jié)段脊髓損傷，傷后第3天重新打開切口，用10滋L微量注射器在脊髓損傷區(qū)遠端1.5mm處注射10滋L細胞懸液（細胞密度1伊106/mL），避開脊髓中央血管，注射過程不少于2min，留置針頭3min以免細胞外泄；聯(lián)合治療組：同法造T10~T11節(jié)段脊髓損傷，受傷1h后用50mg/kg的米諾環(huán)素經(jīng)口灌胃，24h后再次給50mg/kg的米諾環(huán)素經(jīng)口灌胃，然后再予5d的25mg/kg的米諾環(huán)素經(jīng)口灌胃；同時在傷后第3天重新打開切口，用10滋L微量注射器在脊髓損傷區(qū)遠端1.5mm處注射10滋L細胞懸液（細胞密度1伊106/mL），避開脊髓中央血管，注射過程不少于2min，留置針頭3min以免細胞外泄。

動物標本取材及處理：術(shù)后2周，以致死劑量水合氯醛處死大鼠，分別以無菌生理鹽水和4%多聚甲醛行左心室灌注。按原手術(shù)入路取出已損傷部位為中心遠近端各1.5cm長度脊髓。標本在4%多聚甲醛中固定3h，再于新配20%蔗糖溶液浸泡過夜。次日標本沉入蔗糖溶液底部取出，將表面蔗糖溶液吸干。用OCT膠包埋速凍，以損傷中心為目標于冰凍切片機切片，厚度為8滋m，鋪于經(jīng)防脫片處理的載玻片上。進行熒光顯微鏡細胞計數(shù)。

MTT法描繪細胞生長曲線：取4個96孔板，每板分成6組，分別加入準備好的細胞（1伊105/孔），在5%CO2和37益的培養(yǎng)箱中孵育24h后吸出培養(yǎng)液，按照縱行分組在各孔中注入濃度為1、3、6、10、20滋g/mL的米諾環(huán)素培養(yǎng)基溶液及空白對照的全培養(yǎng)基各100滋L。在5%CO2和37益的培養(yǎng)箱中孵育24h后，避光條件下各孔中加入10滋LMTT，繼續(xù)孵育4h后吸出孔內(nèi)混合液體，加入DMSO溶解，震蕩10min。選擇570nm波長，自動酶標光度計測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果。以藥物濃度為橫坐標、吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

統(tǒng)計學分析數(shù)據(jù)以依表示，采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行分析，2組間均數(shù)比較采用檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

熒光顯微鏡觀察脊髓內(nèi)移植的骨髓間充質(zhì)干細胞的情況，結(jié)果顯示米諾環(huán)素前期治療可有效促進細胞的存活和遷移，干細胞移植組和聯(lián)合治療組骨髓間充質(zhì)干細胞數(shù)量分別為7.08依2.71和11.9依2.15，與干細胞移植組相比，聯(lián)合治療組損傷中心可發(fā)現(xiàn)數(shù)量更多的骨髓間充質(zhì)干細胞（<0.05）。損傷組與米諾環(huán)素組由于未進行細胞移植，故未發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細胞。通過MTT法描繪細胞的生長曲線（圖2），反映細胞的生長情況。空白對照組和1、3、6、10、20滋g/mL米諾環(huán)素組骨髓間充質(zhì)干細胞吸光度分別為0.245依0.054、0.263依0.045、0.458依0.085、0.651依0.102、0.619依0.078和0.239依0.051，各組吸光度平均值不全相等（<0.05）。合適濃度的米諾環(huán)素能促進細胞增殖，而隨著米諾環(huán)素濃度的提高細胞增殖能力受到抑制。3、6、10滋g/mL米諾環(huán)素組骨髓間充質(zhì)干細胞吸光度明顯高于空白對照組（<0.001），10滋g/mL米諾環(huán)素組明顯高于20滋g/mL米諾環(huán)素組（<0.001），而空白對照組與1滋g/mL和20滋g/mL米諾環(huán)素組比較，6滋g/mL米諾環(huán)素組與10滋g/mL米諾環(huán)素組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（>0.05）。

米諾環(huán)素是一種半合成的四環(huán)素類廣譜抗生素。研究發(fā)現(xiàn)，米諾環(huán)素具有良好的抑制炎性反應作用［4］，完全不同于其抗感染的作用機制，臨床上用于類風濕性關(guān)節(jié)炎等嚴重的人類炎性疾病的治療。此外，米諾環(huán)素還發(fā)揮神經(jīng)保護的作用，其可以穩(wěn)定線粒體膜，降低其通透性，減少細胞色素C釋放，抑制小膠質(zhì)細胞激活，減少神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細胞的凋亡［5］。相關(guān)研究還顯示［6］，小腦顆粒細胞使用米諾環(huán)素處理后再給予N鄄甲基鄄天冬氨酸處理，檢測神經(jīng)元活力，結(jié)果顯示N鄄甲基鄄天冬氨酸處理細胞活力減少35%，米諾環(huán)素預處理的細胞未出現(xiàn)細胞活力下降，提示米諾環(huán)素對N鄄甲基鄄天冬氨酸誘導的興奮毒性有保護作用。Kumer等［7］在糖尿病大鼠成模4周后給予米諾環(huán)素（50mg/kg）和阿司匹林（50mg/kg）口服，連續(xù)給藥4周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，8周病程的干預組糖尿病大鼠腎功能明顯改善。通過以上實驗可以得出米諾環(huán)素作用廣泛，作為一種抗生素，它不僅可以很好地抑制炎性反應，還可以保護神經(jīng)系統(tǒng)、抑制細胞凋亡、保護腎臟功能。

目前骨髓間充質(zhì)干細胞以其諸多優(yōu)點已經(jīng)成為細胞移植理想的種子細胞［8］。但是從嚴格意義上來講，間充質(zhì)干細胞不具有無限增生的能力，無論在體或者體外，間充質(zhì)干細胞的增生能力是有限的，而且其增生和進入衰老凋亡的過程受到嚴格的分子機制調(diào)控［9］。所以能否找到一種更合適它生長的微環(huán)境便顯得尤為重要。本實驗分別在大鼠體內(nèi)和體外制造米諾環(huán)素微環(huán)境，來觀察其對骨髓間充質(zhì)干細胞生長的影響。在48只脊髓損傷的動物模型中，12只聯(lián)合治療組大鼠的脊髓損傷中心可以觀察到更多骨髓間充質(zhì)干細胞，而在體外合適劑量的米諾環(huán)素對骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖有一定的促進作用。通過以上的結(jié)果，我們可以推測米諾環(huán)素對骨髓間充質(zhì)干細胞的生長起到積極的作用。其可以作為神經(jīng)系統(tǒng)損傷后骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療的鋪墊和輔助。