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基因重組范文第1篇

關(guān)鍵詞：基因突變；基因重組

中圖分類(lèi)號(hào)：G632 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：1002-7661（2013）33-151-01

一、教材內(nèi)容

本章內(nèi)容既是對(duì)前四章內(nèi)容合乎邏輯的延續(xù)，又是學(xué)習(xí)第六章《從雜交育種到基因工程》和第七章《現(xiàn)代生物進(jìn)化理論》的重要基礎(chǔ)。學(xué)好這節(jié)課有助于學(xué)生更好地理解“誘變育種”和 “基因突變是新基因產(chǎn)生的途徑，是生物變異的根本來(lái)源，是生物進(jìn)化的原始材料” 。所以在知識(shí)上它起到了承上啟下的作用，這決定了本節(jié)內(nèi)容的重要性。

二、三維目標(biāo)

知識(shí)目標(biāo)：掌握基因重組的本質(zhì)和特點(diǎn)，會(huì)辨別不同情況下的基因重組。

能力目標(biāo)：借助類(lèi)比活動(dòng)揭示基因結(jié)構(gòu)改變的類(lèi)型、原因，提高學(xué)生判斷、推理等能力。

情感目標(biāo)：通過(guò)生物變異的事例，增強(qiáng)學(xué)生對(duì)生物世界的好奇心。引領(lǐng)學(xué)生自主合作探究.

三、重點(diǎn)難點(diǎn)

（1）重點(diǎn)：基因突變的類(lèi)型、原因、概念、特點(diǎn)。（2）難點(diǎn)：基因突變的意義。

四、教學(xué)方法

（1）針對(duì)基因重組，選擇的教學(xué)模式為：借助孟德?tīng)柕膶?shí)驗(yàn)Ⅱ設(shè)置問(wèn)題情境，引導(dǎo)學(xué)生對(duì)提出的問(wèn)題進(jìn)行探究―觀察現(xiàn)象―分析探索―得出結(jié)論。實(shí)現(xiàn)由舊知到新知的躍遷。

（2）針對(duì)基因突變，選擇的教學(xué)模式為：借助類(lèi)比活動(dòng)：全班同學(xué)抄寫(xiě)黑板上5位司機(jī)的身份證號(hào)統(tǒng)計(jì)抄錯(cuò)的原因？增添、缺失、替換，結(jié)果？

五、課前準(zhǔn)備

教師準(zhǔn)備：一個(gè)堿基序列為ATGGCATGT產(chǎn)生了大量的基因，其中絕大多數(shù)基因的堿基序列是正常，但偶爾也產(chǎn)生了如下4種新基因.如果這四種新基因也能正常表達(dá)，試寫(xiě)出它們轉(zhuǎn)錄和翻譯的產(chǎn)物。

學(xué)生準(zhǔn)備：1、做好相應(yīng)的知識(shí)準(zhǔn)備（減數(shù)分裂、DNA結(jié)構(gòu)和復(fù)制、中心法則、孟德?tīng)栠z傳規(guī)律的相關(guān)內(nèi)容） 2、提前完成課前熱身題小組長(zhǎng)準(zhǔn)備：（要求組長(zhǎng)提前完成統(tǒng)計(jì)工作，上課要做為材料要進(jìn)行類(lèi)比活動(dòng)）

六、課時(shí)安排：1課時(shí)

七、教學(xué)過(guò)程 （打開(kāi)多媒體展示素材）

情景一：

（1）姐妹皮膚的白與黑，油菜籽粒飽滿的種子與普通種子相比，太空椒與普通青椒相比，性狀有明顯的差異，原因何在？

（2）把子粒大而飽滿的種子種下去長(zhǎng)不出同樣好的種子，而是普通種子；把肥大的太空青椒籽種下去可以結(jié)出肥大的青椒。這些現(xiàn)象說(shuō)明什么問(wèn)題？

（3）從上述可以看出生物的變異有幾種類(lèi)型？思維訓(xùn)練：“由環(huán)境引起的變異都是不可遺傳的變異”，對(duì)嗎？

【小結(jié)】可遺傳的變異是生物變異的主要類(lèi)型。它的來(lái)源主要由三個(gè)方面：基因突變、基因重組和染色體變異。？

情景二：孟德?tīng)柕膬蓪?duì)相對(duì)性狀的雜交實(shí)驗(yàn)的現(xiàn)象：

小組討論：1、F1自交得到的F2代出現(xiàn)了幾種性狀表現(xiàn)？比例分別是多少？ 2、F2代中與親代有什么不同的表現(xiàn)型？3、從性狀來(lái)看，變異的概率是多少？4、這種變異產(chǎn)生的原因是什么？

情景三：請(qǐng)分析：1.同源染色體上的非等位基因在什么時(shí)期重新組合？有哪些組合情況？ 2.非同源染色體上的非等位基因在什么時(shí)期重新組合？有哪些組合情況？ 3.基因重組的結(jié)果是什么？它能產(chǎn)生新基因嗎？ 4. 人的體細(xì)胞中有23對(duì)染色體，請(qǐng)你根據(jù)自由組合定律計(jì)算，一位父親可能產(chǎn)生多少種染色體組成不同的，一位母親可能產(chǎn)生多少子種染色體組成不同的卵細(xì)胞？如何理解人群中個(gè)體性狀是多種多樣的？

師生總結(jié)：“基因重組”的概念、時(shí)間、結(jié)果、意義。 “基因重組是可遺傳變異來(lái)源之一”

情景四：基因突變實(shí)例-鐮刀型細(xì)胞貧血癥病因的圖解。

學(xué)生嘗試：結(jié)合鐮刀型細(xì)胞貧血癥的實(shí)例，嘗試總結(jié)基因突變的概念，進(jìn)一步理解 “基因突變產(chǎn)生新基因，基因突變也是產(chǎn)生可遺傳變異的來(lái)源之一”。教師總結(jié)：基因突變?nèi)绻l(fā)生在配子中，將會(huì)遺傳給后代，發(fā)生在體細(xì)胞中的基因突變，一般是不能夠遺傳的。發(fā)生在植物體細(xì)胞中的基因突變，如何能夠遺傳？指導(dǎo)學(xué)生閱讀：教材中有關(guān)基因突變?cè)虻膬?nèi)容。

情景五：癌細(xì)胞是體細(xì)胞發(fā)生基因突變的結(jié)果，在生活中有什么因素容易引發(fā)癌癥，從而發(fā)生基因突變呢？即癌基因突變的具體原因（外因？?jī)?nèi)因？）

情景六： 資料①正常人紅綠色盲病②？人的正常人細(xì)胞癌細(xì)胞③普通羊短腿羊 ④果蠅的紅眼白眼⑤果蠅長(zhǎng)翅殘翅⑥小麥的有芒無(wú)芒⑦低產(chǎn)青霉高產(chǎn)青霉 。

小組活動(dòng)：結(jié)合投影資料1、2能分析出基因突變有什么特點(diǎn)？

教師小結(jié)：即基因突變是新基因產(chǎn)生的途徑，是生物變異的根本來(lái)源

學(xué)生填表：比較基因突變和基因重組

八、教學(xué)反思

適當(dāng)改變了課本內(nèi)容的呈現(xiàn)順序：先講基因重組發(fā)生的時(shí)期、特點(diǎn)，再講基因突變的類(lèi)型、原因、概念、特點(diǎn)和意義，在知識(shí)上實(shí)現(xiàn)了由舊知到新知的躍遷，有利于學(xué)生對(duì)知識(shí)的理解和掌握。在共同探究概念、動(dòng)手體驗(yàn)、合作交流部分注意時(shí)間的分配，一定要給學(xué)生留夠觀察、閱讀、思考、分析、合作的時(shí)間。教師不要獨(dú)霸課堂，真正落實(shí)學(xué)生為主體，教師為主導(dǎo)的理念。

基因重組范文第2篇

關(guān)鍵詞：重組腺病毒；山羊SKIP基因；基因過(guò)表達(dá)；感染細(xì)胞

中圖分類(lèi)號(hào)：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）21-5258-04

Construction of A Recombinant Adenovirus Vector pAd-SKIP

XIONG Qi，ZHANG Nian，SUO Xiao-jun，LI Xiao-feng，LIU Yang，CHEN Ming-xin

（Hubei Key Laboratory of Animal Embryo Engineering and Molecular Breeding / Institute of Animal Husbandry and Veterinary， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064，China）

Abstract： In this study， the Gateway technology was used to construct a recombinant adenovirus vector pAd-SKIP. The SKIP gene was amplified first by PCR and inserted into pcDNA3.1（+） vector， then cloned into adenovirus adshuttle vector pYr-adshuttle-2 to obtain recombinant plasmid pYradshuttle-2-SKIP. The expression cassette of SKIP-EGPF was transferred to pAd/PL-DEST with LR recombinant reaction to acquire recombinant adenovirus plasmid pAd-SKIP-EGFP. The correct clone was linearized and tranformed into 293A cells. Recombinant adenovirus pAd-SKIP was obtained and identified. The transfection efficiency was observed under the fluorescent microscope. The results confirmed that the recombinant adenovirus vector contained goat SKIP gene. This vector was found to infect C2C12 cells efficiently. It indicated that the recombinant adenovirus expressing SKIP gene and green fluorescence was successfully constructed， laying the foundation for further study.

Key words： recombinant adenovirus vector； goat SKIP gene； gene overexpression； infected cells

5′肌醇磷酸酶（SKIP）由Ijuin等[1]首先發(fā)現(xiàn)并分離，在動(dòng)物各組織中廣泛表達(dá)，尤其在心臟骨骼肌和腎臟中高表達(dá)，因此SKIP被稱為骨骼肌和腎臟富含的5′肌醇磷酸酶。SKIP被鑒定為通過(guò)水解PI（3，4，5）P3為PI（3，4）P2而調(diào)控胰島素信號(hào)的5′-脂質(zhì)磷酸酶。PI（3，4，5）P3的下游PI（3，4，5）P3/Akt信號(hào)在成肌分化進(jìn)程中有重要作用[2-4]。SKIP雜合突變小鼠比目魚(yú)肌和股四頭肌的質(zhì)量顯著提高[5]也提示SKIP具有調(diào)節(jié)骨骼肌纖維發(fā)育的功能。因此有必要進(jìn)一步研究該基因在體內(nèi)外參與骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控機(jī)制。本試驗(yàn)采用基因工程技術(shù)，成功構(gòu)建了SKIP基因重組腺病毒，為下一步在體內(nèi)外研究SKIP對(duì)成肌分化的作用機(jī)制以及SKIP基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）和腺病毒穿梭載體pYr-adshuttle-2購(gòu)自長(zhǎng)沙贏潤(rùn)生物技術(shù)有限公司；腺病毒骨架載體pAd/PL-DEST、LR重組酶、DMEM培養(yǎng)液及新生牛血清購(gòu)自Invitrogen公司。限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa公司；CloneEZ試劑盒購(gòu)自Genescript公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、dNTPs、Taq酶及DNA Maker購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；酵母粉和胰蛋白胨購(gòu)自O(shè)xide公司；腺病毒包裝細(xì)胞HEK293購(gòu)自美國(guó)ATCC；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物的設(shè)計(jì)、合成及PCR擴(kuò)增 應(yīng)用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，在上、下游引物5′端分別引入用于定向克隆的限制性酶切位點(diǎn)KpnⅠ、XhoⅠ，同時(shí)在上游引物中添加kozak序列GCCACC，用以增強(qiáng)基因表達(dá)。提取山羊體細(xì)胞RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA為模板擴(kuò)增目的基因，引物序列如下：SKIP-F：5'GGTACCGCCACCATGGAGGCCATGAG3′；SKIP

-R：5'CTCGAGTCAGATCTGTGGCTGGGCTTCAT3′。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s， 75 ℃退火40 s，72 ℃延伸90 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。然后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)是否出現(xiàn)預(yù)期中的SKIP基因帶。

1.2.2 pcDNA3.1（+）-SKIP質(zhì)粒的構(gòu)建 將pcDNA3.1（+）和兩端帶酶切位點(diǎn)的SKIP基因分別以KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離酶切片段，分別回收的線性化pcDNA3.1（+）質(zhì)粒和SKIP cDN段以定向克隆的方式用T4 DNA連接酶連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選菌落擴(kuò)增，小量提取質(zhì)粒后以KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切，若電泳后得到1.3 kb和5.4 kb兩個(gè)片段，則證明SKIP cDNA已插入到真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）上。

1.2.3 SKIP基因克隆至腺病毒穿梭載體pYr-adshuttle-2 用KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切穿梭載體pYr-adshuttle-2和重組表達(dá)載體pcDNA3.1（+）-SKIP，凝膠電泳回收線性化的pYr-adshuttle-2和SKIP基因，用T4 DNA連接酶連接過(guò)夜，反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。次日挑取卡那霉素選擇性培養(yǎng)基篩選的陽(yáng)性克隆子進(jìn)行菌落PCR鑒定；提取質(zhì)粒進(jìn)行KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定；同時(shí)送陽(yáng)性菌落到北京奧科生物公司測(cè)序。

1.2.4 采用LR體外同源重組將SKIP表達(dá)框克隆至腺病毒表達(dá)載體pAd/PL-DEST 在10 μL LR體外同源重組反應(yīng)體系（含pYr-adshuttle-2-SKIP、pAd/PL-DEST和LR Clonase Ⅱ）中，加入蛋白酶K消化LR Clonase Ⅱ。將充分反應(yīng)后得到的反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布于含AmpR抗性（終濃度為100 μg/mL）的LB平板上，37 ℃恒溫箱培養(yǎng)過(guò)夜。接著再次從每個(gè)培養(yǎng)皿上隨機(jī)挑取若干個(gè)單克隆菌落接種于50 mL含AmpR抗性（終濃度為100 μg/mL）的LB培養(yǎng)液中，37 ℃恒溫?fù)u床（250 r/min）培養(yǎng)過(guò)夜。用中量提取試劑盒提取質(zhì)粒，對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行PCR驗(yàn)證XbaⅠ酶切鑒定。

1.2.5 重組腺病毒pAd-SKIP的包裝 HEK293A細(xì)胞的準(zhǔn)備：提前12～24 h將1 mL HEK293A細(xì)胞懸液（1.5×106 個(gè)細(xì)胞/mL）接種在培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)染前1 h換成無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基250 μL。

轉(zhuǎn)染HEK293 A細(xì)胞包裝病毒：用脂質(zhì)體2000介導(dǎo)，由PacⅠ線性化的腺病毒DNA轉(zhuǎn)染HEK293 A細(xì)胞。當(dāng)有明顯的細(xì)胞病態(tài)反應(yīng)（CPE）現(xiàn)象，且有>50%脫壁時(shí)即收細(xì)胞，加入500 μL無(wú)菌PBS緩沖液重懸，干冰浴和37 ℃間快速反復(fù)凍融3次裂解細(xì)胞，室溫下1 000 r/min離心15 min，沉淀細(xì)胞碎屑。將上清液再次感染HEK 293 A細(xì)胞擴(kuò)增病毒，直至細(xì)胞在1周內(nèi)有明顯的CPE現(xiàn)象，且有>50%脫壁時(shí)即收細(xì)胞。同樣用無(wú)菌PBS緩沖液重懸，干冰浴和37℃間快速反復(fù)凍融3次裂解細(xì)胞，室溫下1 000 r/min 離心15 min，收集上清液，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，-80 ℃保存。并進(jìn)行PCR鑒定。

1.2.6 測(cè)定重組腺病毒滴度 取純化后的病毒液100 μL，10%SDS 20 μL、PBS 880 μL，65 ℃熱浴30 min后，渦旋3次，離心后測(cè)定病毒基因組DNA的OD260 nm和OD280 nm，據(jù)此計(jì)算病毒的顆粒數(shù)和純度，1 OD260 nm =1012 PFU/mL，若OD260 nm /OD280nm >1.3，表明純度較高。病毒滴度（PFU/mL）=OD260 nm×稀釋度×1012。

1.2.7 病毒感染C2C12細(xì)胞 將C2C12細(xì)胞（1×106個(gè)細(xì)胞/mL）接種于12孔板，每孔1 mL，12 h后將培養(yǎng)液吸出，各孔分別加入MOI 50～150的Ad-SKIP，常規(guī)培養(yǎng)48 h后，在倒置熒光顯微鏡下分別用可見(jiàn)光和熒光觀察、成像。

2 結(jié)果與分析

2.1 pcDNA3.1（+）-SKIP的酶切鑒定結(jié)果

用KpnⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，PCR擴(kuò)增SKIP基因的正反向引物分別帶有KpnⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。將含有插入方向正確的SKIP cDNA的重組pcDNA3.1（+）-SKIP經(jīng)KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切產(chǎn)生大小分別為1.3 kb和5.4 kb的片段（圖1）。

2.2 pYr-adshuttle-2-SKIP的重組鑒定結(jié)果

將SKIP基因連接入pYr-adshuttle-2載體，陽(yáng)性克隆經(jīng)KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，pYr-adshuttle-2載體大小為4 470 bp，SKIP基因大小約為1 350 bp，由酶切結(jié)果（圖2）可知，該克隆為正確克隆。將酶切鑒定正確的pYr-adshuttle-2-SKIP送去測(cè)序。并將測(cè)序結(jié)果與欲得到的目的序列相比對(duì)，顯示獲得的SKIP基因片段序列完全正確，證實(shí)pYr-adshuttle-2-SKIP構(gòu)建成功。

2.3 重組腺病毒載體pAd-SKIP的鑒定

將SKIP基因表達(dá)框采用LR體外重組技術(shù)克隆至表達(dá)載體pAd/PL-DEST，陽(yáng)性克隆經(jīng)XbaⅠ單酶切鑒定，可切出一條約550 bp和一條約2.3 kb的條帶，且大帶大于8 kb（實(shí)際有3條大帶，即18 kb、8 kb、8 kb，但是一般很難分開(kāi)，所以看上去就是一條粗帶）。由圖3結(jié)果可以初步判斷pAd-SKIP構(gòu)建成功。接著以質(zhì)粒pAd-SKIP為模板，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增SKIP片段，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可見(jiàn)，PCR擴(kuò)增出的片段大小與SKIP基因片段大小一致，證實(shí)pAd-SKIP載體構(gòu)建成功。

2.4 重組腺病毒rAd-SKIP的產(chǎn)生和PCR鑒定

將PacⅠ線性化的腺病毒DNA轉(zhuǎn)染HEK293A，當(dāng)細(xì)胞有明顯的CPE現(xiàn)象，且有>50%脫壁時(shí)即收細(xì)胞進(jìn)行裂解收病毒。提取腺病毒基因組DNA，以之為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。引物用載體上自帶的CMV和BGH引物驗(yàn)證。由PCR鑒定結(jié)果（圖4）可知，用載體上自帶的引物擴(kuò)增出與SKIP基因長(zhǎng)度同樣大小的片段，表明此腺病毒中有SKIP基因，而且相關(guān)表達(dá)框都在。證實(shí)rAd-SKIP包裝成功。

2.5 重組腺病毒對(duì)成肌細(xì)胞C2C12的感染

用不同MOI的重組腺病毒感染C2C12細(xì)胞，當(dāng)MOI為150時(shí)，超過(guò)80%的細(xì)胞出現(xiàn)熒光（圖5），表明所構(gòu)建的重組腺病毒生物活性高，可以有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)目的基因表達(dá)。

3 小結(jié)與討論

SKIP是調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號(hào)通路的關(guān)鍵5′肌醇磷酸酶。在肌源細(xì)胞中，血清饑餓可誘導(dǎo)IGF2自分泌。IGF2與IGF1受體互作，激活PI3K，產(chǎn)生PI-3，4，5-P3，PI-3，4，5-P3募集到細(xì)胞膜上激活A(yù)kt（蛋白激酶B），接著激活成肌基因的轉(zhuǎn)錄[5]。因此PI3K-Akt信號(hào)與成肌分化緊密相關(guān)。近年來(lái)，一些新的信號(hào)通路、分泌因子和信號(hào)分子不斷被發(fā)現(xiàn)能調(diào)控PI3K-Akt信號(hào)。如肌醇磷酸酶SKIP，它通過(guò)水解PI3K合成的脂質(zhì)第二信使PI-3，4，5-P3，參與Akt（蛋白激酶B）的激活[6-8]。但SKIP是否調(diào)控PI3K-Akt信號(hào)介導(dǎo)的成肌分化仍有待研究。

基因的過(guò)表達(dá)是研究基因功能的重要手段之一，將外源基因有效地導(dǎo)入靶細(xì)胞表達(dá)是后續(xù)研究的先決條件。腺病毒（Adenovirus）是目前最高效可靠的重組病毒表達(dá)系統(tǒng)之一，可用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中瞬時(shí)及高水平地表達(dá)目的蛋白。具備宿主范圍廣，不依賴細(xì)胞周期，病毒滴度高，有較好的生物安全性等優(yōu)點(diǎn)[9]。腺病毒表達(dá)系統(tǒng)中的難點(diǎn)主要在于如何將外源基因表達(dá)框或者外源的shRNA表達(dá)框構(gòu)建至腺病毒骨架載體上。由于腺病毒骨架載體比較大（～30 kb），而且載體中的一些常用酶切位點(diǎn)幾乎都有多個(gè)，如果用常規(guī)的酶切-連接的方式將外源基因或者shRNA表達(dá)框構(gòu)建至腺病毒骨架載體上，則成功率很低，因此，目前的腺病毒表達(dá)系統(tǒng)基本上都是用同源重組的方法將外源基因構(gòu)建至腺病毒骨架載體上。

本試驗(yàn)采用了Invitrogen公司的BLOCK-iT腺病毒表達(dá)系統(tǒng)和Gateway 技術(shù)，與市面上其他腺病毒表達(dá)系統(tǒng)往往利用大腸桿菌或者293細(xì)胞自身的同源重組系統(tǒng)不同，即利用LR 重組酶進(jìn)行體外重組。與當(dāng)前其他腺病毒表達(dá)系統(tǒng)相比，這種體外重組更加方便、快速，重組效率更高。在本研究中，構(gòu)建了含山羊SKIP基因的腺病毒載體，并且經(jīng)酶切鑒定分析和PCR結(jié)果證實(shí)SKIP重組病毒構(gòu)建成功。病毒滴度高，并且可以高效感染C2C12細(xì)胞，表達(dá)能有效介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染，為下一步證實(shí)SKIP對(duì)骨骼肌細(xì)胞成肌分化的調(diào)控等研究奠定了基礎(chǔ)。

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基因重組范文第3篇

【摘要】 目的 構(gòu)建鴨乙型肝炎病毒（DHBV）感染性克隆，通過(guò)體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染獲得單一來(lái)源、基因序列清楚的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的感染毒種。方法 以湖北麻鴨DHBV分離株（DQ276978）為模板，用PCR法從該DHBV全基因組克隆質(zhì)粒（pMD-DHBV）和DHBV陽(yáng)性血清中獲取3部分基因片段，總長(zhǎng)44kb，克隆至載體PCR21的SacI和NotI酶切位點(diǎn)，構(gòu)建含15倍鴨乙型肝炎病毒全基因的重組質(zhì)粒，并酶切鑒定其插入方向。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體LipofectineTM 2000導(dǎo)入雞肝癌細(xì)胞系(LMH)細(xì)胞中轉(zhuǎn)染表達(dá)，收集純化后的轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清液作為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)感染的標(biāo)準(zhǔn)毒種。結(jié)果 PCR鑒定、酶切鑒定及序列測(cè)定，證實(shí)成功獲得正向插入的1.5倍鴨乙型肝炎病毒全基因重組質(zhì)粒PCR2.1-DHBV1.5。Southernblot檢測(cè)表明，該重組質(zhì)粒在LMH細(xì)胞內(nèi)存在各種病毒復(fù)制中間體；通過(guò)電鏡觀察，轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清液中存在DHBV完整病毒顆粒。結(jié)論 經(jīng)體外重組，構(gòu)建出攜帶1.5倍加長(zhǎng)DHBV基因組片段的重組質(zhì)粒PCR21-DHBV15，并可在雞肝癌細(xì)胞LMH中介導(dǎo)高水平病毒復(fù)制，從而獲得含可自我復(fù)制病毒顆粒的轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清液作為動(dòng)物體內(nèi)感染接種物。

【關(guān)鍵詞】 鴨乙型肝炎病毒

鴨乙型肝炎病毒（DHBV）與人類(lèi)乙型肝炎病毒（HBV）同屬嗜肝DNA病毒科，它們?cè)谛螒B(tài)結(jié)構(gòu)、基因序列、病毒復(fù)制、致病機(jī)制及感染宿主規(guī)律等方面均較為相似，DHBV感染鴨模型使人們認(rèn)識(shí)了嗜肝病毒的復(fù)制周期以及病毒持續(xù)存在和病毒徹底清除的機(jī)制。我們?cè)趯?duì)湖北麻鴨DHBV自然感染率調(diào)查的基礎(chǔ)上，選擇對(duì)DHBV易感且取材方便的湖北麻鴨作為實(shí)驗(yàn)鴨種，并分離出1株DHBV新毒株（DQ276978）〔1〕。進(jìn)而以該毒株為模板，構(gòu)建了15倍DHBV全基因重組質(zhì)粒，通過(guò)該質(zhì)粒在雞肝癌細(xì)胞系(LMH)中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)出含有可自我復(fù)制的病毒顆粒的細(xì)胞培養(yǎng)上清液作為單一來(lái)源、基因序列清楚的實(shí)驗(yàn)毒種，以期建立標(biāo)準(zhǔn)化的湖北麻鴨乙型肝炎病毒體內(nèi)模型。另外，將該DHBV重組質(zhì)粒與不同劑量人類(lèi)載脂蛋白BmRNA編輯酶催化多肽3G(APOBEC3G)真核表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染LMH細(xì)胞，通過(guò)抑制實(shí)驗(yàn)以證實(shí)該DHBV體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷某醪綉?yīng)用。

1 材料與方法

11 材料

111 質(zhì)粒 pMD-DHBV為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的含有湖北麻鴨（DQ276978）DHBV DNA全長(zhǎng)基因組的質(zhì)粒；pSP65-DHBV16為雙拷貝頭尾相接的全基因DHBV DNA重組質(zhì)粒，該克隆質(zhì)粒(美國(guó) Mandart 教授饋贈(zèng))；APOBEC3G真核表達(dá)質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存；PCR21載體(美國(guó)Invitrogen公司)。

112 DHBV陽(yáng)性血清 取自擴(kuò)增出DHBV DNA全長(zhǎng)基因組（DQ276978）的陽(yáng)性血清。

113 細(xì)胞 禽類(lèi)雞肝癌細(xì)胞系LMH，為本室傳代保存。

114 工具酶 LA Taq酶、限制性內(nèi)切酶EcoR I、BamH I、Sac I、Kpn I、Not I及凝膠回收試劑盒(大連 TAKARA公司)；Taq DNA聚合酶(美國(guó)Promega公司)；T4DNA連接酶(美國(guó)GIBICO公司)。

115 生化及其它試劑 地高辛(DIG)標(biāo)記及檢測(cè)試劑盒(德國(guó)Roche公司)；Waymouth 細(xì)胞培養(yǎng)基(美國(guó)Sigma公司)；LipofectineTM2000(美國(guó)Invitrogen公司)。DNA凝膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒(德國(guó)QIAGEN公司)；質(zhì)粒提取試劑盒和動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞基因組DNA純化試劑盒(大連TaKR公司)。

12 方法 通過(guò)對(duì)湖北麻鴨（DQ276978）DHBV DNA的全長(zhǎng)克隆質(zhì)粒的序列限制酶切圖譜分析〔1〕，已明確其基因組的結(jié)構(gòu)及與復(fù)制相關(guān)的重要元件的序列位置，在此基礎(chǔ)上運(yùn)用3片法構(gòu)建出能自我復(fù)制的重組質(zhì)粒。

121 構(gòu)建質(zhì)粒PCR 21-DHBV15 用EcoRI和BamHI雙酶切pMD-DHBV，得到目的片段DA（DHBV3024/0nt-1473nt）；設(shè)計(jì)引物DB1/DB2和DC1/DC2分別經(jīng)PCR擴(kuò)增DHBV陽(yáng)性血清獲得目的片段DB（1473nt-2870nt）和DC（1395-3024/0nt）。將上述3片段插入PCR21的相應(yīng)酶切位點(diǎn)后即得到15倍DHBV全基因重組質(zhì)粒PCR21-DHBV15。

122 PCR鑒定 引物Ps1/Ps2和Pc1/Pc2為DHBV基因S區(qū)和C區(qū)的高度保守序列段，引物序列如下：Ps1（1318F）5′-TGGCCTAATCGGATTACTGG-3′，Ps2（1739R）5′-CAGCGTGGCTAATTGAGTTA-3′；Pc1（187F）5′-GCAATCACTAGACCAATCCA-3′，Pc2（397R）5′-GAGATCTATGGTGGCTGCTC-3′。PCR反應(yīng)液組成：10×Buffer5μl;MgCl2（25mmol/L）3μl;dNTP（10mmol/L）1μl;Ps1/Ps2或Pc1/Pc2各1μl；Taq酶1μl；DHBV模板5μl；加滅菌純水至50μl。PCR循環(huán)參數(shù)：94℃5min；94℃50s，61℃45s，72℃50s，40個(gè)循環(huán)；72℃10min。

123 酶切鑒定 用BamHI，SacI和EcoR I，Not I和EcoRI，Sac I和BamH I分別進(jìn)行酶切鑒定。

124 序列測(cè)定 取一株陽(yáng)性克隆質(zhì)粒送上海生物工程技術(shù)服務(wù)公司測(cè)序。

125 脂質(zhì)體LipofectineTM2000介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)染 在LMH細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，設(shè)未轉(zhuǎn)染LMH細(xì)胞對(duì)照和pSP65-DHBV16質(zhì)粒對(duì)照。

126 蛋白印跡(Southern Blot)分析 提取轉(zhuǎn)染LMH細(xì)胞內(nèi)總DNA后，用DIG標(biāo)記的DHBV全長(zhǎng)基因組探針雜交，X-ray膠片發(fā)光顯影。

127 轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清液中病毒顆粒電鏡觀察 收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清液，離心后用磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解沉淀，將該沉淀溶解物通過(guò)磷鎢酸負(fù)染法進(jìn)行電鏡觀察。

128 APOBEC3G真核表達(dá)質(zhì)粒對(duì)DHBV的抑制效應(yīng)實(shí)驗(yàn) 質(zhì)粒PCR21-DHBV15分別與不同劑量（20和40μg）的APOBEC3G真核表達(dá)質(zhì)粒pXF3G-HA通過(guò)LipofectamineTM2000共同轉(zhuǎn)染LMH細(xì)胞，72h后收集細(xì)胞。

2 結(jié)果

21 重組質(zhì)粒PCR21-DHBV15的PCR鑒定 重組質(zhì)粒PCR21-DHBV15經(jīng)不同引物C1/C2、S1/S2、DB1/DB2和DC1/DC2擴(kuò)增后可產(chǎn)生依次為211，452，1 430和1 600的目的片段（圖1）。

22 重組質(zhì)粒PCR21-DHBV15的酶切鑒定 未酶切的重組質(zhì)粒PCR21-DHBV15為84kb；用SacI和EcoRI雙酶切該重組質(zhì)?？僧a(chǎn)生29和55kb的片段；該重組質(zhì)粒經(jīng)BamHI限制性內(nèi)切酶消化后產(chǎn)生31和53kb的目的片段；用NotI和EcoRI雙酶切PCR21-DHBV15可產(chǎn)生16和68kb的片段；用SacI和BamHI限制性內(nèi)切酶消化該重組質(zhì)粒后則產(chǎn)生16和68kb的目的片段。上述酶切結(jié)果均與預(yù)期相符（圖2）。

23 轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清液中DHBV病毒顆粒的檢測(cè) 在轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清液中檢出大量直徑為30～65nm的球形顆粒，其中一種為大小較均一，直徑為40～50nm的實(shí)心病毒，有核心和球形包膜，即完整病毒顆粒；另一種是直徑為30～65nm的類(lèi)球形空心病毒，中央凹陷，未見(jiàn)絲狀、管狀體，即病毒表面抗原顆粒（圖3）。

24 轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)DHBV DNA的檢測(cè) 分別將pSP65-DHBV16和PCR21-DHBV15轉(zhuǎn)染LMH細(xì)胞，72h后收集細(xì)胞，提取DNA進(jìn)行Southernblot檢測(cè)。結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒PCR21-DHBV15與雙拷貝DHBV全長(zhǎng)基因組質(zhì)粒pSP65-DHBV16一樣，均在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中檢出大量DHBV DNA復(fù)制中間體（圖4）。

M：DL2000 Marker;1：primer C1/C2;2：primer S1/S2;3：primer DB1/DB2；4：primer DC1/DC2

圖1 重組質(zhì)粒PCR21-DHBV15的PCR鑒定（略）

M1：1Kb Marker;1：PCR2.1-DHBV1.5；2：PCR2.1-DHBV1.5/SarI+EcoR I;3：PCR2.1-DHBV1.5/BamH I;4：PCR2.1-DHBV1.5/Not I+EcoR I;5：PCR2.1-DHBV1.5V/Sac I+BamH I;M2：500bp Lad der

圖2 重組質(zhì)粒PCP2.1-DHBV1.5的酶切鑒定（略）

25 APOBEC3G對(duì)DHBV核衣殼相關(guān)DNA水平具有劑量依賴的抑制效應(yīng) 重組質(zhì)粒PCR21-DHBV15分別與不同劑量（20和40μg）的APOBEC3G真核表達(dá)質(zhì)粒pXF3G-HA共同轉(zhuǎn)染LMH細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后Southern blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的DHBV核衣殼相關(guān)DNA的結(jié)果顯示，APOBEC3G對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)DHBV核衣殼相關(guān)DNA水平具有劑量依賴的抑制效應(yīng)（圖5）。

圖3 重組質(zhì)粒PCR21-DHBV15轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清液(×60000)（略）

1：pSP65-DHBV16;2:PCR2.1-DHBV1.5;RC：松弛環(huán)狀DNA；L：線性DNA；SS：?jiǎn)捂淒NA

圖4 Southern blot 檢測(cè)轉(zhuǎn)細(xì)胞內(nèi)DBBV復(fù)制水平（略）

PCR21-DHBV1.5(μg)

20 20 20

pX F3G-HA (μg)

- 20 40

pXF3H(μg)

40 20 -

pXF3H：真核表達(dá)載體；

pXF3H-HA：APOBEC3G真核表達(dá)質(zhì)粒

圖5 APOBE3G對(duì)細(xì)胞內(nèi)DHBV核衣殼相關(guān)DNA水平的抑制（略）

3 討論

在HBV己證實(shí)，構(gòu)建13倍加長(zhǎng)或頭尾相接雙拷貝的基因組，可以產(chǎn)生所有HBV轉(zhuǎn)錄子，并啟動(dòng)HBV的復(fù)制〔2〕。土拔鼠肝炎病毒(WHV)研究也有類(lèi)似的結(jié)果〔3〕。LMH是DHBV穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系〔4，5〕，它能支持DHBV克隆病毒的復(fù)制，并能分泌完整病毒顆粒。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)湖北麻鴨DHBV分離株(DQ276978)的DNA全長(zhǎng)基因組核苷酸水平和氨基酸水平的序列分析研究〔1〕，成功構(gòu)建了15倍加長(zhǎng)DHBV基因組重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定、酶切鑒定以及序列測(cè)定均證明所構(gòu)建的重組體與預(yù)期相符，包含能高效自我啟動(dòng)DHBV復(fù)制的全部元件。核酸水平研究和電鏡觀察也證實(shí)該重組質(zhì)粒能夠在LMH細(xì)胞中利用DHBV固有的增強(qiáng)子和啟動(dòng)子進(jìn) 行有效復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，由此也證明所構(gòu)建的重組體可以用于體內(nèi)基因免疫，為其后建立鴨體內(nèi)實(shí)驗(yàn)感染標(biāo)準(zhǔn)化模型提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。另外，我們進(jìn)一步用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的APOBEC3G真核表達(dá)質(zhì)粒和PCR21-DHBV15重組質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染LMH細(xì)胞系進(jìn)行抑制實(shí)驗(yàn)以證實(shí)該DHBV體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷某醪綉?yīng)用。APOBEC3G是一種天然免疫分子，具有抗病毒感染的效應(yīng)〔6，7〕。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，APOBEC3G能明顯降低DHBV核衣殼相關(guān)DNA的水平，并且顯示出劑量依賴性，表明APOBEC3G也可能非特異性地抑制DHBV復(fù)制，但其作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

【參考文獻(xiàn)】

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基因重組范文第4篇

【關(guān)鍵詞】 肝炎病毒

關(guān)鍵詞 :肝炎病毒，乙型;聚合酶鏈反應(yīng);腺病毒科 中圖號(hào):Q74 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

0 引言

乙型肝炎是一種常見(jiàn)傳染病，危害極大.我們通過(guò)PCR及基因重組技術(shù)將adr亞型乙型肝炎病毒表面抗原HB-sAg基因克隆到腺病毒穿梭載體，構(gòu)建了重組HBsAg腺病毒穿梭載體，為制備HBsAg腺病毒疫苗的研制打下了基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 材料

模板pⅡ1.2（含HBV adr亞型全基因序列）根據(jù)《分子克隆》的操作，采用堿裂解法大量制備質(zhì)粒pⅡ1.2，紫外分光光度法定量.PCR引物的設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增HBV S區(qū)基因的引物，由上海生工公司合成，序列:For:cgtcta-gagggaacaagagctacagcatg.Rev:cgtctagataagggaatagccccaacg 1.2 方法 根據(jù)ExpandTM High Fidelity PCR System

（寶靈曼公司）操作說(shuō)明進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系:pⅡ1.2100ng，HBsFor及Rev300nmol?L

-1 ，dNTP200mol?L-1 ，總反應(yīng)體積50μL.循環(huán)參數(shù)如下:94℃2min;94℃，15s;56℃，30s;68℃，1min;循環(huán)30次，72℃，7min.Klenow酶（Promega公司）補(bǔ)平PCR片段，KpnⅠ/HindⅢ（華美公司）雙酶切，用T4DNA連接酶（Promega公司）將酶切片段克隆入pUC18載體的相同酶切位點(diǎn)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli JM109，挑單菌落擴(kuò)增，各取2μL菌液進(jìn)行PCR反應(yīng)，并提取質(zhì)粒用KpnⅠ/HindⅢ雙酶切鑒定陽(yáng)性克隆，重組質(zhì)粒命名為pUC/HBs.任選一陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行DNA自動(dòng)測(cè)序.將KpnⅠ/HindⅢ雙酶切pUC/HBs所得片段按上述方法亞克隆入pAdCMV載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli JM109，PCR法及KpnⅠ/HindⅢ雙酶切鑒定陽(yáng)性克隆，重組質(zhì)粒命名為pAdCMV/HBs.

2 結(jié)果

經(jīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增出HBV S區(qū)基因片斷大小約1250bp.隨機(jī)挑5個(gè)轉(zhuǎn)化菌單菌落擴(kuò)增，其中4個(gè)轉(zhuǎn)化菌PCR反應(yīng)及酶切鑒定同時(shí)陽(yáng)性.隨機(jī)挑4個(gè)轉(zhuǎn)化菌單菌落擴(kuò)增，4個(gè)轉(zhuǎn)化菌PCR反應(yīng)及酶切鑒定皆陽(yáng)性.

基因重組范文第5篇

關(guān)鍵詞：uPA；GFP；腺相關(guān)病毒載體；基因轉(zhuǎn)染

中圖分類(lèi)號(hào)：Q786　文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A　文章編號(hào)：1007－7847(2007)03－0242－06

尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase typeplasminogen activator，uPA)自身有直接降解基底膜及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的作用，uPA還可通過(guò)激活纖溶酶及基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)降解ECM，uPA激活肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子間接對(duì)損傷腎臟起保護(hù)作用，因此uPA在降解ECM、逆轉(zhuǎn)纖維化方面起重要作用，腎臟纖維化的病理改變主要是腎小球硬化和，腎小管間質(zhì)纖維化，是腎臟ECM合成與降解失衡，導(dǎo)致ECM過(guò)度積聚的結(jié)果，因此，我們?cè)O(shè)想采用高效表達(dá)載體-腺相關(guān)病毒(adeno-associatedvirus，AAV)載體，將uPA基因全長(zhǎng)序列轉(zhuǎn)移到有纖維化病變的部位，以增強(qiáng)病變局部uPA的表達(dá)，發(fā)揮其降解ECM的作用，從而緩解腎纖維化的進(jìn)程，為臨床治療腎臟纖維化提供理論基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1．1　材料

AAV Helper-Free System(#240071)、pAAV-IRES-hrGFP(#240075)、AAV-293細(xì)胞(#240073)和XL10-Gold感受態(tài)細(xì)菌(#200314)購(gòu)自美國(guó)Stratagene公司，TRIzol regent(15596-018)購(gòu)自美國(guó)invitrogen公司，Reverse Transcription System(A3500)、pGEM-T EasyⅡ(A1380)，L4 DNA ligase(#M1801)、Wizard PureFection Plasmid DNA Pu-rification System(A1330)購(gòu)自美國(guó)Promega公司，DNA Ladder Mix(#SM033 1)、Taq DNA polymerase(EP0404)、dNTP Mix(R0191)購(gòu)自美國(guó)Fermen-tas MBI公司，限制性核酸內(nèi)切酶BamH](R0136V)、Xho I(R0146V)購(gòu)自美國(guó)NEW ENG-LAND Biolabs公司，Gel Extraction Mini Kil(Z0021A)購(gòu)自中國(guó)長(zhǎng)沙安比奧公司，引物For-ward Primer：5′-TYCGGATCCCCATGAGAGTCTG-GCTTGC-3′，Reverse Primer：5′-TGGCTCGAGTCAGAAGGCTAGGCCATTC-3′，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，測(cè)序由上海生工生物技術(shù)有限公司完成，兔抗Flag M2抗體(F1804-200UG)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，2周齡SD雄性大鼠購(gòu)自中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，腎小管上皮細(xì)胞由中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院小兒腎臟病研究室保存。

1．2　方法

1．2．1　大鼠腎臟uPA基因的獲得

取Spragoc-Dawleg 2周齡雄性幼鼠，按TRI-ZOL一步法提取腎臟總mRNA，逆轉(zhuǎn)錄合成eD-NA第一鏈，PCR法特異擴(kuò)增uPA cDNA，1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，uPA cDNA為1299bp，用GelExtraction Mini Kit回收酶切產(chǎn)物，置pH8.0 TE緩沖液中，uPA cDNA-20℃保存。

1．2．2　pGEM-T-uPA重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將uPA cDNA用T4 DNA ligase連接到pGEM-T Easy載體上，并轉(zhuǎn)染到JM 109感受態(tài)細(xì)菌，涂于含氨芐青霉素的瓊脂平板表面，置37℃恒溫箱倒置培養(yǎng)14～16h，作氨芐青霉素抗性篩選，挑選固體平板上長(zhǎng)勢(shì)良好的白色菌落6個(gè)，分別接種于3mLLB培養(yǎng)液內(nèi)(Amp)，于37℃搖床內(nèi)培養(yǎng)14h增菌，將6管菌液各取1.5mL，按Puprep PIasmid Miniprep Kit說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒，得到pGEM-T-uPA重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒用BamHI/Xho I雙酶切后，證實(shí)含相應(yīng)的uPA基因片斷，用Gel Extraction Mini Kit回收uPA基因片斷，-20℃保存。

1．2．3　pAAV-hrGFP-uPA重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將上一步驟中獲得的uPA基因片段用T4DNA ligase連接到pAAV-IRES-hrGFP質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)，并轉(zhuǎn)染到XL 10-Gold感受態(tài)細(xì)菌，涂于含氨芐青霉素的瓊脂平板表面，置37℃溫箱倒置培養(yǎng)14～16h，作氨芐青霉素抗性篩選，挑選固體平板上長(zhǎng)勢(shì)良好的白色菌落6個(gè)，分別接種于3mL LB培養(yǎng)液內(nèi)(Amp)，于37℃搖床內(nèi)振搖培養(yǎng)14～16h增菌，將6管菌液各取1.5mL，按Puprep Plasmid Miniprep Kit說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒，得到DAAV-hrGFP-uPA重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒用BamH I/Xho I雙酶切后，證實(shí)含uPA基因片斷，DAAV-hrGFP-uPA重組質(zhì)粒送檢測(cè)序，準(zhǔn)備足夠的pAAV-hrGFP-uPA重組質(zhì)粒和其他兩個(gè)輔助質(zhì)粒oAAV-RC和pHelper，用Wizard Pure FectionPlasmid DNA Purification System提取超純質(zhì)粒，供下一步轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

1．2．4　AAV-293細(xì)胞培養(yǎng)

AAV-293細(xì)胞來(lái)源于普通的HEK293細(xì)胞系，但是可以產(chǎn)生較高的病毒滴度，HEK293是轉(zhuǎn)染了腺病毒5型DNA的人胚胎腎細(xì)胞，AAV-293細(xì)胞在含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，AAV-293細(xì)胞貼壁不牢，輕吹大瓶壁即可傳代，在細(xì)胞達(dá)到50％融合時(shí)傳代，且傳代不宜超過(guò)20代，同時(shí)注意傳代和接種時(shí)不要讓細(xì)胞

成塊。

1．2．5　pAAV-hrGFP-uPA的產(chǎn)生及鑒定

接種3×106個(gè)AAV-293細(xì)胞于100mm培養(yǎng)皿中，加入含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)2d細(xì)胞達(dá)到70％～80％融合時(shí)，吸取每個(gè)質(zhì)粒溶液pAAV-hrGFP-uPA質(zhì)粒、pAAV-RC和pHelper(濃度均為1g/L)各10μg加入到15mL柱狀試管中，再加入1mL 0.3mol/L的CaCl2，輕輕混勻，加入1mL 2×HBS于另一柱狀試管中，滴加上述1.03mL DNA/CaCl4混合物，反復(fù)吹打混勻，以點(diǎn)滴方式加入DNA/CaCl2/HBS懸液于AAV-293細(xì)胞的培養(yǎng)皿中，旋轉(zhuǎn)均勻分散該DNA懸液，將培養(yǎng)皿放人37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h，培養(yǎng)結(jié)束后，添加10mL新鮮的含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，培養(yǎng)結(jié)束后，收集培養(yǎng)基和細(xì)胞于15mL的柱狀試管中，經(jīng)過(guò)4次冰凍和解凍(37℃)循環(huán)，每次持續(xù)10min，然后于室溫中離心(10000g)10min，轉(zhuǎn)移上清(初病毒儲(chǔ)存液)于另一新的試管中置-80℃保存，Buffer TE代替質(zhì)粒作陰性對(duì)照，轉(zhuǎn)染后48h倒置熒光顯微鏡觀察GFP表達(dá)，以確定轉(zhuǎn)染成功；轉(zhuǎn)染后72h收集病毒顆粒，并將獲得的病毒顆粒再次感染AAV-293細(xì)胞，以確定其感染能力。

1．2．6　病毒載體的純化與滴度測(cè)定

對(duì)重組的pAAV-hrGFP-uPA用親和層析、離子交換層析和分子篩層析進(jìn)行純化：純化后用斑點(diǎn)雜交方法檢測(cè)重組病毒的滴度；利用高壓液相層析(HPLC)法檢測(cè)重組病毒的純度，具體方法參照文獻(xiàn)。

1．2．7　uPA基因轉(zhuǎn)染腎小管細(xì)胞及其表達(dá)的測(cè)定

按每孔1.5×105個(gè)腎小管細(xì)胞接種于12孔培養(yǎng)平板中，培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)到70％融合，每孔添加終濃度為4mol/L羥基脲和1mol/L丁酸納，混勻后，放人培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5～6h，吸出培養(yǎng)基，加入1.5mL預(yù)溫的含20％小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基和相應(yīng)的病毒存儲(chǔ)液0.5mL，繼續(xù)培養(yǎng)48h，培養(yǎng)結(jié)束后。倒置熒光顯微鏡觀察GFP表達(dá)，uPA基因的表達(dá)以Flag標(biāo)記蛋白進(jìn)行免疫組化染色來(lái)判斷，一抗為兔抗Flag M2抗體(1:200)，二抗為生物素化的羊抗兔抗體，加SABC孵育后進(jìn)行DAB顯色。

2　結(jié)果

2．1　uPA cDN段的獲得

用RT-PCR法擴(kuò)增大鼠uPA eDNA 1299 bP片段，瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)所得到的基因片段是正確的(圖1)。

2．2 pAAV-hrGFP-uPA重組質(zhì)粒的酶切鑒定

pAAV-hrGFP-uPA重組質(zhì)粒經(jīng)BamH I/Xho I雙酶切后得到1299 bp的uPA基因片段，表明pAAV-hrGFP-uPA重組質(zhì)粒的構(gòu)建正確(圖2)。

2．3　pAAV，hrGFP-uPA重組質(zhì)粒DNA序列分析

證實(shí)pAAV-hrGFP-uPA序列完全正確，無(wú)堿基突變。

2．4　pAAV-hrGFP-uPA的產(chǎn)生

分別取 pAAV-hrGFP-uPA和pAAV-RC、pHelper質(zhì)粒各10μg，經(jīng)磷酸鈣沉淀法共轉(zhuǎn)染AAV-293細(xì)胞2～3d，Buffer TE代替質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞作陰性對(duì)照，陰性對(duì)照平皿中AAV-293細(xì)胞長(zhǎng)滿后有少量細(xì)胞漂浮，但平皿上一直布滿細(xì)胞，培養(yǎng)基變成桔黃色，提示陰性對(duì)照沒(méi)有病毒顆粒產(chǎn)生，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的AAV-293細(xì)胞逐漸聚集成團(tuán)并漂離平皿，培養(yǎng)基中有大量漂浮細(xì)胞，培養(yǎng)基的顏色由桔黃色變?yōu)辄S色，細(xì)胞腫脹、變圓，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組在倒置熒光顯微鏡下觀察，可見(jiàn)細(xì)胞呈綠色，表明轉(zhuǎn)染成功(圖3、4)。

2．5　uPA基因轉(zhuǎn)染腎小管上皮細(xì)胞及其表達(dá)

AAV-293細(xì)胞產(chǎn)生的病毒顆粒轉(zhuǎn)染腎小管上皮細(xì)胞，48h后在倒置熒光顯微鏡下觀察約60％～70％的腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白，免疫組化法觀察到腎小管上皮細(xì)胞可有效表達(dá)flag蛋白，細(xì)胞質(zhì)中具有較多的棕黃色顆粒，陰性對(duì)照組均沒(méi)有綠色熒光蛋白和flag蛋白的表達(dá)(圖5、6)。

3 討論

腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化歸根結(jié)底是腎臟ECM合成與降解失衡導(dǎo)致ECM過(guò)度積聚的結(jié)果，目前已知參與ECM降解的酶主要有3類(lèi)：1)絲氨酸蛋白酶；2)基質(zhì)金屬蛋白酶；3)半胱氨酸蛋白酶，其中主要是前兩類(lèi)，uPA屬于絲氨酸蛋白酶家族，uPA的主要作用是器官形態(tài)發(fā)生、組織修復(fù)和腫瘤浸潤(rùn)，uPA自身有直接降解基底膜及ECM的作用，uPA還能切斷纖溶酶原中脯氨酸-甘氨酸-精氨酸-纈氨酸序列中的精氨酸-纈氨酸連接，催化無(wú)活性的纖溶酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w溶酶，uPA對(duì)纖溶酶原的激活是一個(gè)正反饋逐級(jí)放大效應(yīng)，纖溶酶是一廣譜蛋白酶，能夠降解存在于基底膜和，ECM的各種糖蛋白包括血纖維蛋白、粘連蛋白、層連蛋白和蛋白多糖中的核心蛋白，進(jìn)而溶解血管內(nèi)的纖維蛋白凝塊和ECM成分，并形成細(xì)胞外局部溶解區(qū)。構(gòu)成細(xì)胞轉(zhuǎn)移的通道，有利于新生的內(nèi)皮細(xì)胞遷移、生長(zhǎng)進(jìn)入周?chē)|(zhì)，形成新的微血管；uPA又可激活MMPs，該酶是鋅依賴性內(nèi)肽酶，是參與基質(zhì)降解的主要成分；還能激活肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子是一個(gè)有力的抗纖維化因子，對(duì)損傷腎臟有保護(hù)作用，基因治療器官組織纖維化已成為慢性疾病治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，利用各種有效的和組織特異性的載體系統(tǒng)將降解ECM的外源基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)，到達(dá)纖維化的組織和器官，可緩解纖維化程度，有研究報(bào)道腺病毒攜帶人uPA基因可誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性肝硬化動(dòng)物模型的肝硬化緩解，uPA促進(jìn)HGF從基質(zhì)中釋放并活化，緩解肺纖維化，因此，利用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)增強(qiáng)uPA基因的表達(dá)可能會(huì)大大降解ECM成分，緩解腎臟纖維化。

由于腎臟細(xì)胞的有絲分裂指數(shù)較低，腎臟基因的轉(zhuǎn)移效率至今仍不理想，因此，我們以新型的無(wú)輔腺相關(guān)病毒AAV-2作為載體，采用基因克隆技術(shù)，成功構(gòu)建了攜帶uPA基因和綠色熒光蛋白(green fluorescence protein，GFP)基因的腺相關(guān)病毒重組質(zhì)粒，用來(lái)轉(zhuǎn)移基因，本實(shí)驗(yàn)中所選用的pAAV-IRES-hrGFP質(zhì)粒作為攜帶目的基因的主要載體，能同時(shí)表達(dá)目的基因蛋白、GFP和Flag蛋白，質(zhì)粒中的GFP可作為病毒顆粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞成功與否及細(xì)胞定位的有效標(biāo)記，F(xiàn)lag蛋白僅作為標(biāo)簽提示目的基因蛋白的表達(dá)，還可用來(lái)分析未知基因表達(dá)的情況，腺相關(guān)病毒(adeno-asso-ciated virus，AAV)屬微小病毒科，能高效轉(zhuǎn)染到各種宿主細(xì)胞中，AAV作為基因治療載體的優(yōu)勢(shì)主要有：1)AAV是一種人源性的病毒，對(duì)人體無(wú)

致病性，免疫反應(yīng)輕微，有利于體內(nèi)轉(zhuǎn)染；2)可定點(diǎn)整合至人的19號(hào)染色體，并能較穩(wěn)定的存在，從而避免了其它病毒隨機(jī)整合可能引起的抑癌基因失活和原癌基因激活的危險(xiǎn)；3)AAV攜帶的外源基因可以長(zhǎng)期持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)，并可調(diào)控；4)AAV的宿主范圍很廣，包括分裂期和非分裂期的多種細(xì)胞：5)具有較好的熱穩(wěn)定性和抗酸堿性(pH 3.0～9.0)以及抗有機(jī)溶劑處理的特點(diǎn)，便于儲(chǔ)存，AAV基因組具有兩個(gè)開(kāi)放的閱讀框架(ORF)，兩端各有1個(gè)145bp的末端反向重復(fù)序列(ITR)，ORF編碼非結(jié)構(gòu)性蛋白(Rep)和衣殼蛋白(Cap)，Rep蛋白在病毒的整合、復(fù)制、包裝中起重要作用，Cap蛋白是包裝成完整病毒所需的衣殼蛋白，因此，重組AAV載體(rAAV)是用外源目的基因單位(包括啟動(dòng)子)替換AAV兩端ITR系列之間的基因系列(Rep和Cap基因)而產(chǎn)生，傳統(tǒng)制備rAAV載體包裝系統(tǒng)主要包括：重組載體、輔助質(zhì)粒(如Ad8)、輔助病毒(如Ad5)和宿主細(xì)胞，該方法的缺點(diǎn)是可導(dǎo)致腺病毒蛋白的污染，容易導(dǎo)致機(jī)體對(duì)載體的免疫反應(yīng)，各項(xiàng)研究通過(guò)改造AAV載體基因結(jié)構(gòu)、包裝細(xì)胞以及改進(jìn)病毒顆粒的純化方法，可達(dá)到更高的病毒產(chǎn)率，rAAV載體經(jīng)過(guò)不斷改進(jìn)和完善，已經(jīng)克服了容量小和解決無(wú)腺病毒輔助的大量包裝和復(fù)制問(wèn)題：近年來(lái)又由于包裝細(xì)胞系的誕生，加上其固有的優(yōu)點(diǎn)，因而成為治療遺傳性疾病和慢性疾病最有前途的基因載體。

本實(shí)驗(yàn)在培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞中直接觀察到GFP的表達(dá)，提示病毒顆粒成功轉(zhuǎn)染細(xì)胞，pAAV-hrGFP-uPA能高效在腎小管細(xì)胞中表達(dá)，大約有60％～70％的腎小管細(xì)胞可感染此病毒顆粒，并整合到腎小管細(xì)胞中穩(wěn)定、高效表達(dá)，F(xiàn)lag蛋白的表達(dá)反應(yīng)了uPA蛋白表達(dá)的情況，GFP可在450-490nm的藍(lán)光激發(fā)下發(fā)出綠光，GFP的多肽中含有絲氨酸-脫氫酪氨酸-甘氨酸的環(huán)化結(jié)構(gòu)，使GFP具有強(qiáng)烈的熒光性，GFP作為一種基因表達(dá)的標(biāo)記物優(yōu)于傳統(tǒng)的報(bào)告基因，如LacZ、CAT、luc等編碼酶蛋白的基因，GFP優(yōu)點(diǎn)在于：1)GFP基因序列短、分子質(zhì)量小、融合后不影響目的基因的表達(dá)和靶蛋白生理功能，不干擾細(xì)胞的生長(zhǎng)和功能，且對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用，因而能在活細(xì)胞狀態(tài)下檢測(cè)基因表達(dá)；2)觀察更為方便，GFP是一種能在活細(xì)胞內(nèi)直接觀測(cè)、無(wú)需底物和內(nèi)對(duì)照的報(bào)告基因，將GFP基因轉(zhuǎn)染至真核細(xì)胞中表達(dá)后，可以方便地通過(guò)觀察活細(xì)胞中GFP融合蛋白的綠色熒光分布，分析未知基因表達(dá)蛋白在細(xì)胞中的分布和定位，因此GFP作為一種極具潛力的標(biāo)記物為研究基因功能及表達(dá)調(diào)控提供了極大的便利。

本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了高效轉(zhuǎn)染多種宿主細(xì)胞的重組載體質(zhì)粒，為今后建立AAV-μPA基因治療的體內(nèi)腎纖維化模型奠定了良好的基礎(chǔ)，并且為無(wú)特殊標(biāo)記細(xì)胞移植治療提供了一種穩(wěn)定、有效的標(biāo)記方法，可以追蹤該細(xì)胞在體內(nèi)的分布或分化情況。