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本文作者：周永春王熙才陳艷金從國(guó)劉馨姚乾黃尤光陳曉群伍治平黃云超作者單位：昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院/云南省腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所

實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增效率評(píng)價(jià)及實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株的篩選

本研究前期共提取了10株肺癌細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞的總RNA，各組細(xì)胞總RNA的D260/D280均為1.9～2.1，提示RNA純度較高；1%RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)其RNA完整性較好，適合作為RT-PCR模板。在RNA反轉(zhuǎn)錄后，取倍比稀釋的sox4和GAPDHcDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增效率評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示sox4和內(nèi)參基因GAPDH的擴(kuò)增曲線相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.99，符合使用2－ΔΔCt方法分析sox4mRNA相對(duì)表達(dá)量的前提條件。以人肺上皮細(xì)胞LEC作為校正，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與肺腺癌細(xì)胞A549以及GLC、人胎肺細(xì)胞KMB-17、人肺腺癌細(xì)胞H157、個(gè)舊肺鱗癌細(xì)胞YTMLC、大細(xì)胞肺癌細(xì)胞H460和高轉(zhuǎn)移性大細(xì)胞肺癌細(xì)胞H460SM相比，宣威女性肺癌細(xì)胞XWLC-05中的sox4mRNA表達(dá)水平最高（圖1），因此選用該細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

高干擾效果sox4-siRNA的篩選及其轉(zhuǎn)染細(xì)胞后sox4表達(dá)的變化

PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染sox4-siRNA2的XWLC-05細(xì)胞中sox4mRNA的表達(dá)無(wú)明顯變化，而轉(zhuǎn)染sox4-siRNA1和sox4-siRNA3的XWLC-05細(xì)胞中sox4mRNA的表達(dá)水平明顯降低，其中sox4-siRNA3的抑制率最高（圖2A），因此選用sox4-siRNA3進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)sox4-siRNA3轉(zhuǎn)染XWLC-05細(xì)胞后24、48和72h時(shí)，sox4mRNA表達(dá)的變化。結(jié)果顯示，24h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；48h和72h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中sox4mRNA的表達(dá)水平與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比均明顯降低（48h時(shí)的P值分別為0.000和0.001，72h時(shí)的P值分別為0.000和0.001），其中以轉(zhuǎn)染后48h時(shí)的抑制作用最為明顯（圖2B）。空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染后48h和72h時(shí)的sox4mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯差異（P值分別為0.815和0.506）。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果亦顯示，sox4-siRNA3轉(zhuǎn)染后24、48和72h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中sox4蛋白的相對(duì)表達(dá)水平分別為0.203±0.034、0.046±0.026和0.092±0.018。其中，24h時(shí)各組之間的sox4蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；48h和72h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，sox4蛋白表達(dá)水平明顯下降（48h時(shí)的P值分別為0.000和0.003，72h時(shí)的P值分別為0.044和0.031），其中以轉(zhuǎn)染后48h時(shí)的下降幅度最為明顯（圖2C）。空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組各時(shí)段sox4蛋白的表達(dá)無(wú)明顯差異（P值分別為0.111、0.077和0.101）。

抑制sox4表達(dá)對(duì)XWLC-05細(xì)胞增殖的影響

倒置顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)組、空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組細(xì)胞均生長(zhǎng)良好，呈均一透明的貼壁狀態(tài)，增殖速度、生長(zhǎng)密度和大體形態(tài)無(wú)明顯差異（圖3A）。MTS法檢測(cè)結(jié)果（圖3B）顯示，轉(zhuǎn)染sox4-siRNA3的實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，細(xì)胞增殖無(wú)明顯差異（P值分別為0.059和0.113），空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組之間的差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.650）。

抑制sox4表達(dá)對(duì)XWLC-05細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖3C～D）顯示，劃痕后培養(yǎng)48h時(shí)，各組細(xì)胞均向劃痕區(qū)遷移，轉(zhuǎn)染sox4-siRNA組細(xì)胞的遷移距離明顯短于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P值分別為0.000和0.023），空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組之間的遷移距離差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.090）。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖3E～F）顯示，轉(zhuǎn)染sox4-siRNA后48h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)為（142.0±4.2）個(gè)，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均為0.000）；而空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[分別為（591.0±3.5）個(gè)和（559.0±4.9）個(gè)，P＝0.372）。實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞經(jīng)染色后，洗脫液的D值與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.000和0.001），而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.566）。上述結(jié)果表明，抑制sox4表達(dá)可顯著降低XWLC-05細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

抑制sox4表達(dá)對(duì)XWLC-05細(xì)胞周期及凋亡的影響

FCM檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染sox4-siRNA348h后，實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)典型的DNA水平小于二倍體的亞G1凋亡峰，凋亡率為（29.12±5.37）%，較空白對(duì)照組細(xì)胞凋亡率[（0.46±1.33）%]和陰性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率[（0.41±2.30）%]顯著升高（P值均為0.000，圖4），而實(shí)驗(yàn)組PI與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.168和0.225，表3），空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組之間的凋亡率和PI差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.733和0.992）。

云南省宣威地區(qū)女性高發(fā)肺癌，近年來(lái)受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。本院收治的宣威女性肺癌患者除表現(xiàn)為對(duì)常規(guī)放化療不敏感的共性外，還顯示出發(fā)病年齡年輕化、轉(zhuǎn)移早、對(duì)現(xiàn)有靶向治療不敏感和預(yù)后差的特點(diǎn)。作為轉(zhuǎn)錄因子，sox4除在人類胚胎的發(fā)育和分化中扮演重要角色以外[11]，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中也具有重要作用。

在細(xì)胞嚴(yán)謹(jǐn)有序的分化和發(fā)育過(guò)程中，sox4基因的突變、缺失或過(guò)表達(dá)均可能導(dǎo)致細(xì)胞分化障礙以及增殖和凋亡失控，從而參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。既往研究揭示，sox4在不同類型腫瘤中具有致癌基因的作用[12-15]，也可作為一種抑制因素影響腫瘤的生長(zhǎng)[16,17]。這些作用機(jī)制涉及sox4對(duì)細(xì)胞信號(hào)通路的調(diào)節(jié)、對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控、對(duì)微小RNA（microRNA）的表達(dá)調(diào)控以及對(duì)細(xì)胞增殖和分化的調(diào)控等。在肺癌領(lǐng)域，目前的研究多集中于sox4表達(dá)差異及突變方面[10]，最近也有學(xué)者通過(guò)高通量芯片技術(shù)致力于探討受sox4調(diào)節(jié)的下游靶基因，并證實(shí)小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌中均有sox4的過(guò)表達(dá)，受其影響的下游基因多達(dá)123個(gè)，且在不同類型的肺癌中存在差異[18]。

然而，目前尚不明確sox4在肺癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中的確切機(jī)制。本研究通過(guò)對(duì)10株不同類型肺癌細(xì)胞和正常細(xì)胞株進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)sox4mRNA在正常人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B和人肺上皮細(xì)胞LEC中呈現(xiàn)低表達(dá)，而在胚胎細(xì)胞KMB-17中呈現(xiàn)高表達(dá)，符合其作為胚胎發(fā)育調(diào)節(jié)基因的本質(zhì)。此外，與正常肺及支氣管細(xì)胞相比，sox4在各類型肺癌細(xì)胞中均表現(xiàn)為過(guò)表達(dá)，推測(cè)其與惡性腫瘤細(xì)胞去分化的特點(diǎn)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，宣威女性肺癌細(xì)胞XWLC-05中的sox4mRNA表達(dá)水平相對(duì)較高，因此采用RNA干擾技術(shù)抑制該基因在XWLC-05細(xì)胞中的表達(dá)，試圖探討sox4在宣威肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用。XWLC-05細(xì)胞系由昆明醫(yī)學(xué)院病理教研室于2007年建立，是目前唯一以宣威女性肺癌為來(lái)源建立的細(xì)胞株，材料取自宣威當(dāng)?shù)匾幻?8歲的女性肺腺癌患者（右肺中分化腺癌）。實(shí)驗(yàn)證明，該細(xì)胞株維持了原腫瘤的表型特征，能夠形成與宣威女性肺癌具有相同形態(tài)學(xué)特征的裸鼠移植瘤[19]。因此，選擇該細(xì)胞作為體外研究的對(duì)象，能夠最大程度地反映宣威女性肺癌的生物學(xué)特征。

為了避免只選擇一個(gè)序列可能出現(xiàn)RNA干擾無(wú)效或低效的情況，本研究選擇了sox4基因編碼序列中3個(gè)可能的干擾位點(diǎn)，并篩選出干擾效應(yīng)最強(qiáng)的sox4-siRNA3進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，同時(shí)通過(guò)設(shè)置陰性對(duì)照以排除可能出現(xiàn)的假陽(yáng)性結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，sox4-siRNA能夠在mRNA和蛋白水平顯著降低腫瘤細(xì)胞中sox4的表達(dá)，且抑制效應(yīng)在轉(zhuǎn)染后48h時(shí)最強(qiáng)，這與siRNA的瞬時(shí)干擾作用相符，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)均選用轉(zhuǎn)染后48h時(shí)的細(xì)胞作為研究對(duì)象。

MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性的原理與傳統(tǒng)的MTT法相同，但因?yàn)榍罢卟恍枰獙?duì)細(xì)胞進(jìn)行沖洗以及額外添加DMSO，也不需要收獲細(xì)胞，可直接進(jìn)行比色，因此兼具了MTT法快速、安全和靈活的特點(diǎn)，同時(shí)操作更加簡(jiǎn)便，敏感度更高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也更加準(zhǔn)確而可靠[20]。本研究利用MTS法檢測(cè)XWLC-05細(xì)胞轉(zhuǎn)染sox4-siRNA后的增殖活性，結(jié)果顯示與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，轉(zhuǎn)染前后顯微鏡下的細(xì)胞形態(tài)學(xué)也與空白對(duì)照組無(wú)明顯差異。FCM結(jié)果也顯示，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞的增殖率無(wú)顯著差異，提示sox4可能并不參與調(diào)控XWLC-05細(xì)胞的增殖。不過(guò)，轉(zhuǎn)染48h后的FCM檢測(cè)結(jié)果卻提示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的亞二倍體峰，其凋亡率較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組明顯升高，提示sox4可能在XWLC-05細(xì)胞的凋亡中起一定的作用，這與Liu等[12]在前列腺癌中的研究結(jié)果一致。

基膜是阻止腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)械屏障，而Matrigel是從富含細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的EHS小鼠腫瘤中提取出的基膜基質(zhì)，主要成分包括層黏連蛋白、膠原Ⅳ、巢蛋白和硫酸肝素糖蛋白等，還包含生長(zhǎng)因子和基質(zhì)金屬蛋白酶等。在室溫條件下，Matrigel聚合形成具有生物學(xué)活性的三維基質(zhì)，可以模擬體內(nèi)細(xì)胞基膜的結(jié)構(gòu)、組成、物理特性和功能。本研究結(jié)果顯示，抑制sox4表達(dá)可以降低XWLC-05細(xì)胞對(duì)Matrigel的穿膜能力，同時(shí)劃痕實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞遷移率顯著降低，提示sox4與XWLC-05細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移表型密切相關(guān)。結(jié)合FCM檢測(cè)結(jié)果，推測(cè)抑制細(xì)胞凋亡可能是sox4增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞惡性行為的機(jī)制，但對(duì)其具體的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究利用siRNA成功抑制了宣威女性XWLC-05肺癌細(xì)胞中sox4的表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，抑制sox4表達(dá)后腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力均下降，雖然細(xì)胞增殖未受到明顯影響，但細(xì)胞凋亡明顯增加。本研究結(jié)果為下一步構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染模型和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)，也為以sox4作為肺腺癌治療靶點(diǎn)的研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。