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國內(nèi)光遺傳學(xué)最新進展范文第1篇

關(guān)鍵詞：棉花（Gossypium hirsutum L.）；抗黃萎??；轉(zhuǎn)基因育種

中圖分類號：S562；S435.621 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）23-5673-03

棉花（Gossypium hirsutum L.）產(chǎn)業(yè)是我國的支柱產(chǎn)業(yè)之一，為廣大棉農(nóng)每年帶來400億～600億元的直接經(jīng)濟收入，為城鎮(zhèn)提供近3 000萬個就業(yè)崗位。棉花生產(chǎn)的發(fā)展關(guān)系到國計民生，地位舉足輕重。在阻礙我國棉花生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的諸多因素中，棉花黃萎病的危害是其主要因素之一。

1 棉花黃萎病的危害

棉花黃萎病是世界毀滅性病害，病原菌為大麗輪枝菌（Verticillium dahlia Kleb），自從傳入我國以來，危害逐年蔓延和加重。1993年黃萎病暴發(fā)成災(zāi)，全國棉花發(fā)病面積270萬hm2，遍及各主要產(chǎn)棉區(qū)[1，2]；2003年棉花黃萎病流行面積達320萬hm2，造成2.3億kg的皮棉產(chǎn)量損失[3]。據(jù)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所的研究，7月下旬前發(fā)病平均減產(chǎn)高達66.9%，7月下旬后發(fā)病平均減產(chǎn)仍達20.3%。早期遭受落葉型和急性萎焉型黃萎病危害時，容易造成棉株死亡導(dǎo)致絕收。

2 棉花抗黃萎病轉(zhuǎn)基因育種的研究進展

棉花黃萎病屬土傳維管束病害，病原菌寄主范圍廣，并存在明顯的致病力分化現(xiàn)象，防治困難。在綜合防治措施中，化學(xué)防治很難奏效并易造成環(huán)境污染；生物防治技術(shù)雖然表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景，但因生防因子?；蕴珡姸萍s了該技術(shù)的推廣應(yīng)用；對于重病田，不得不輪作倒茬，但仍不能徹底解決問題。惟一經(jīng)濟、有效、環(huán)保的防治措施是使用抗病棉花新品種。在國家的高度重視和大力支持下，棉花生產(chǎn)用種的品種改良得到長足發(fā)展，但從現(xiàn)有育成品種來看，仍不能滿足棉花生產(chǎn)的現(xiàn)實需求，兼?zhèn)湄S產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗、廣適的棉花新品種極少，尤其是沒有兼抗棉花黃萎病的新品種。究其原因，主要是因為陸地棉遺傳基礎(chǔ)狹窄，種內(nèi)缺乏優(yōu)良的抗病資源。馬存等[4]曾對中國現(xiàn)存的近5 000份棉花品種資源進行抗黃萎鑒定，高抗黃萎病的材料均為海島棉或野生棉，1 512份陸地棉資源中，沒有發(fā)現(xiàn)免疫或高抗黃萎病的材料，抗黃萎病的也僅占0.8%。利用常規(guī)技術(shù)對陸地棉進行抗病性遺傳改良時，存在周期長、效率低、性狀間負向連鎖累贅難以克服等困難。所以僅僅依靠傳統(tǒng)育種技術(shù)實現(xiàn)抗黃萎病等多個育種目標聚合的難度較大。隨著植物抗病分子生物學(xué)的發(fā)展，利用各種抗病基因或誘發(fā)抗病基因以增強植物抗病性，在各種作物分子改良中得到廣泛應(yīng)用，抗病分子育種的條件已趨于成熟，為尋找棉花抗病基因、創(chuàng)制新的抗源材料開辟了新途徑。

利用基因工程和遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)針對棉花抗黃萎病正在進行的研究方向有：①棉花抗黃萎病基因的定位和克隆。如Ve1基因首先從歐薄荷中克隆得到[5]，隨后在番茄[6]、陸地棉[7]中都進行了功能驗證，證明其對棉花黃萎病具有顯著抗性；最近在擬南芥中克隆得到的AHL19基因與棉花黃萎病的抗性存在很大關(guān)聯(lián)性[8]。②棉花分解脫氧半棉酚（Desoxyl hemigossypol，dHG）酶基因的克隆。棉花體內(nèi)酚類物質(zhì)主要可分為棉酚（Gossypol，G）、半棉酚（Hemigossypol，HG）、脫氧半棉酚（Desoxyl hemigossypol，dHG）等，已經(jīng)證實其中HG和dHG的含量受黃萎病菌（Verticillium dahliae Kleb）侵染誘導(dǎo)，并且對黃萎病菌有一定的毒性[9]。許多科學(xué)家希望能克隆此基因，然后利用反義基因技術(shù)，抑制該酶的含量，從而達到培育抗黃萎病棉花品種的目的。③分離黃萎病病原菌的毒素，克隆該毒素基因，進一步分離棉花中的解毒酶。研究證明黃萎病菌致萎毒素主要是酸性糖蛋白，這種糖蛋白毒素破壞了棉株的組織結(jié)構(gòu)，引起萎蔫甚至死亡[10]。④分離系統(tǒng)獲得性抗性（Systematic acquired resistance，SAR）中起關(guān)鍵作用的基因，利用誘導(dǎo)性抗性培育抗病品種。植物在病原菌“激發(fā)子”（Elicitor）的誘導(dǎo)下產(chǎn)生過敏性反應(yīng)（HR），一系列防衛(wèi)相關(guān)基因的表達也隨之變化，使得這種抗性水平逐漸擴展到整株，形成對病原菌侵染的廣譜抗性[11]。

目前應(yīng)用的基因主要有幾丁質(zhì)酶、β-1，3-葡聚糖酶、植物防衛(wèi)素、硫素及葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase，GO）等外源抗病基因，并已獲得轉(zhuǎn)基因抗病棉花株系[12]。蔡應(yīng)繁等[13]利用基因槍法、葉盤法和花粉管通道途徑等基因工程技術(shù)將抗真菌的β-1，3-葡聚糖酶基因和幾丁質(zhì)酶基因?qū)朊藁?，?jīng)PCR檢驗，得到陽性結(jié)果。吳家和等[14]把幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶通過根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入陸地棉品種冀合321和中棉所35基因組，獲得了轉(zhuǎn)基因棉花，經(jīng)過檢測，7個轉(zhuǎn)化株均表現(xiàn)出不同程度的抗黃萎病或耐黃萎病特性。樂錦華等[15]將菜豆中的幾丁質(zhì)酶和煙草中的葡聚糖酶基因轉(zhuǎn)入棉花，并篩選出了高抗黃萎病的品系。齊俊生等[16]利用棉花黃萎病菌強致病力落葉型V991菌系的毒素誘導(dǎo)高抗黃萎病的海島棉品種，獲得一個抗黃萎病基因At7，并導(dǎo)入陸地棉，從而培育出高抗黃萎病的新株系。肖月華等[17]從棉花植株中分離克隆了多個具有抗病功能的基因，篩選出抗黃萎病的棉花品種。陳大軍等[18]將天麻抗真菌蛋白基因轉(zhuǎn)入天然彩色棉主栽品種，選育出既抗枯萎病又抗黃萎病的兼抗材料。Murray等[19]將來自Talaromycesflavus的GO基因轉(zhuǎn)入棉花，使棉株對根部大麗輪枝菌產(chǎn)生了一定的抗菌活性。劉慧君等[20]將GO基因轉(zhuǎn)入棉花，轉(zhuǎn)基因后代對枯萎病和黃萎病抗性均有顯著提高，部分材料抗性達到抗病水平。Degray等[21]通過研究抗菌肽MSI-99在葉綠體基因組中的表達獲得了能夠高效表達的轉(zhuǎn)基因煙草植株。轉(zhuǎn)基因植株葉片提取物能夠抑制曲霉菌（Aspergillus sp.）、鐮刀菌（Fusarium sp.）、黃萎病菌等3種真菌孢子的生長，抑菌效果高達95%。此外，Degray等[21]將D4E1基因序列在35S RNA啟動子引導(dǎo)下通過農(nóng)桿菌法轉(zhuǎn)入煙草中，獲得了高抗黃萎病的植株，其葉片提取粗蛋白能夠抑制99%黃萎病菌的萌發(fā)。

溶菌酶是一類廣泛存在于自然界、對多種革蘭氏陽性菌和陰性菌以及某些真菌或病毒具有殺滅作用的水解酶類。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所將蛋清溶菌酶HEWL基因和T4噬菌體溶菌酶基因利用畢赤酵母進行重組表達，發(fā)現(xiàn)表達產(chǎn)物對棉花枯萎病菌和黃萎病菌均具有明顯的抗性，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將植物表達載體轉(zhuǎn)化陸地棉珂字312以及R15品系，獲得了轉(zhuǎn)基因種子，其ELISA、PCR檢測表達量較高的有多個株系，從初步篩選的陽性植株中獲得多株高抗黃萎病菌的棉株，其中，繁殖后命名為DHGH-1和T4GH-1的棉株已進入安全評價中間試驗。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是一種有益的土壤細菌，具有發(fā)達的分泌系統(tǒng)、很強的環(huán)境適應(yīng)性和抗逆性，能分泌多種抗菌物質(zhì)。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所從枯草芽孢桿菌菌株B111中提取得到抗菌蛋白BS2，其對棉花黃萎病菌、枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、小麥紋枯病菌（Rhizoctonia cerealis）、稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）、水稻條斑病菌（Bacterial leaf streak）、白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）等病原菌均具有抗性，尤其對棉花落葉型黃萎病菌具有較強的抑制作用，但對畢赤酵母無影響。將該蛋白酶基因?qū)虢湍钢蝎@得有效表達，重組蛋白同時具有蛋白酶活性和抗菌活性。同時，利用枯草芽孢桿菌的內(nèi)生性特性將該菌株定殖在棉株中，能有效促進棉株發(fā)育，提高棉株的抗病性和棉花產(chǎn)量。

在棉花轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)方面，主要有花粉管通道法、基因槍轟擊法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法3種方法。目前農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化因再生體系比較成熟，能轉(zhuǎn)移人工分離和修飾過的外源基因，成功率高，外植體的適用范圍廣，轉(zhuǎn)化的外源基因以單拷貝或雙拷貝為多數(shù)，遺傳穩(wěn)定性好，是棉花上應(yīng)用最廣泛的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)[22]。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因棉花所用的選擇標記基因有nptII、hpt、Bar基因等；轉(zhuǎn)化的目的基因包括抗蟲、抗除草劑、抗病、抗逆、雄性不育、提高油酸含量和纖維品質(zhì)改良等基因；外植體包括子葉、下胚軸、子葉節(jié)、葉柄、莖尖和胚性愈傷組織等。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院還建立了棉花轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系平臺，通過將農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍轟擊法、花粉管通道法的有效整合，達到了每年轉(zhuǎn)化8 000株的規(guī)模。

3 結(jié)語

通過轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)將抗黃萎病基因轉(zhuǎn)移到陸地棉中，創(chuàng)造抗性強的棉花新材料，可望從根本上解決陸地棉黃萎病抗原嚴重缺乏的問題，也必將為棉花抗黃萎病育種開拓廣闊的前景。

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