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九江八河范文第1篇

2、二龍戲珠,二人同心,二三其德,二八佳人

3、三陽(yáng)開(kāi)泰,三從四德,三山五岳,三頭六臂

4、四面八方,四通八達(dá),四海五湖,四平八穩(wěn)

5、五光十色,五顏六色,五福臨門,五洲四海

6、六六大順,六月飛雪,六畜興旺,六出奇計(jì)

7、七步之才,七步成詩(shī),七日來(lái)復(fù),七長(zhǎng)八短

8、八珍玉食,八仙過(guò)海,八方呼應(yīng),八斗之才

9、九江八河,九九歸一,九五之尊,九霄云外

九江八河范文第2篇

【摘要】 p300是一種具有組蛋白乙?；富钚缘霓D(zhuǎn)錄輔助因子，HDAC1是一種組蛋白去乙?；?。本研究查明姜黃素對(duì)B-NHL細(xì)胞株Raji細(xì)胞增殖的影響，并探討這種影響與p300以及HDAC1轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)表達(dá)的關(guān)系。 以不同濃度(6.25-50 μmol/L)的姜黃素作用于體外培養(yǎng)的Raji細(xì)胞，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，Annexin-V-FITC/PI雙標(biāo)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率和應(yīng)用RT-PCR 和Western blot法檢測(cè)Raji細(xì)胞中HDAC1和p300的mRNA表達(dá)和蛋白含量的變化。結(jié)果表明： 姜黃素對(duì)Raji細(xì)胞抑制作用呈明顯的時(shí)效和量效關(guān)系。24小時(shí)的IC50為25 μmo/L；姜黃素能夠誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡，凋亡率為14.38%-61.18%，并呈濃度依賴性。姜黃素明顯抑制HDAC1和p300的活性和表達(dá)。在IC50濃度時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，其p300和HDAC1 mRNA表達(dá)和蛋白含量逐漸降低，呈時(shí)間依賴性，與對(duì)照組相比有顯著性(P

【關(guān)鍵詞】 B淋巴瘤

Regulatory Effect of Curcumin on p300 and HDAC1 in B-NHL Cells

Abstract The purpose of this study was to investigate the effect of curcumin on proliferation of B-NHL Raji cell line and explore the relationship between this effect and regulatory expression of p300 and HDAC1 transcription.The in vitro cultured Raji cells were treated with curcumin at various concentrations (6.25-50 μmol/L) and at different time points (0，6，12，24 and 48 hours)，the inhibitory ratio of cell growth was measured by MTT assay，the cell apoptosis rate was detected by flow cytometry with Annexin V-FITC/PI double staining，the changes of p300 and HDAC1 mRNA expression and protein level in Raji cells were determined by RT-PCR and Western blot.The results showed that the curcumin could inhibit Raji cell proliferation in significant time-and concentration-dependent manners，IC50 at 24 hours was 25 μmol/L; the curcumin could induce apoptosis of Raji cells in concentration-dependent manner，apoptosis rate was 14.38%-61.18%.The curcumin significantly inhibited activity and expression of p300 and HDAC1.At IC50 concentration，expression of p300 and HDAC1 mRNA and protein level decreased with time-dependent manner，difference between tested and control groups was significant (P

Key words curcumin; B-NHL; Raji cell; p300; HDAC1

姜黃素(curcumin，Cur)是從姜黃根莖中提取的一種酚性色素，其藥理作用特性有抗炎、抗腫瘤、抗動(dòng)脈硬化、抗病毒等。體外研究表明，姜黃素抑制癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡是通過(guò)多條通路和調(diào)節(jié)多種腫瘤表面標(biāo)記因子實(shí)現(xiàn)的，而且其作用靶點(diǎn)可以從DNA、mRNA到蛋白質(zhì)水平［1］。

p300是一種重要的組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶，它能乙?；诵慕M蛋白N末端的賴氨酸殘基使核小體組蛋白與DNA的結(jié)合穩(wěn)定性下降，進(jìn)而使轉(zhuǎn)錄機(jī)器與染色體的結(jié)合成為可能［2］。在細(xì)胞中可與多種基因轉(zhuǎn)錄活化因子結(jié)合而形成輔化因子復(fù)合體。除乙?；饔猛?，p300還可以在轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體的形成中起支架或橋梁的作用［2］。目前研究表明，在多種腫瘤中p300可發(fā)生多種形式的基因突變，提示

p300具有促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的作用［3］。

組蛋白乙?；?HAT)和組蛋白去乙酰化酶(HDAC)在真核細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要的作用，調(diào)節(jié)核內(nèi)蛋白質(zhì)的乙?；脚c基因轉(zhuǎn)錄。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，HAT/HDAC活性紊亂會(huì)使基因表達(dá)失控，從而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生［4］。

本研究查明姜黃素對(duì)Raji細(xì)胞組蛋白去乙?；窰DAC1的作用，觀察轉(zhuǎn)錄共激活因子p300的表達(dá)情況，探討姜黃素抗腫瘤的分子機(jī)制。

材料和方法

材料

藥物

姜黃素，購(gòu)自Sigma公司，純度>99%，溶解于二甲亞砜（DMSO），分裝備用。

細(xì)胞系

B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株Raji細(xì)胞購(gòu)自上海科學(xué)院細(xì)胞中心。在含有10%的胎牛血清、青霉素100 U/ml及鏈霉素100 U/ml的RPMI 1640培養(yǎng)液中37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。每48小時(shí)換液傳代1次。取生長(zhǎng)良好、細(xì)胞活性大于98%的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

主要試劑

RPMI 1640培養(yǎng)液(Gibco產(chǎn)品)，胎牛血清(中山凌飛公司產(chǎn)品)，溴化二甲噻唑二苯四氮唑(MTT，Sigma產(chǎn)品) 組蛋白去乙?；窰DAC1抗體，p300抗體均購(gòu)自Santa Cruze公司，其中HDAC1為鼠抗人單克隆抗體，p300為兔抗人多克隆抗體，羊抗鼠及兔抗鼠二抗和Bio-Rad蛋白定量試劑盒、TRIzoL均購(gòu)自晶美公司。

方法

細(xì)胞培養(yǎng)

將Raji細(xì)胞接種于含10%滅活胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在5% CO2、37℃、飽和濕度下培養(yǎng)，每2天換液1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別用不同濃度的姜黃素處理細(xì)胞，未加藥組為對(duì)照組。根據(jù)MTT法測(cè)得的姜黃素對(duì)Raji細(xì)胞作用的IC50為25 μmol/L，并用IC50濃度的姜黃素作用0、6、12、24及48小時(shí)，檢測(cè)HDAC1和p300蛋白及mRNA的變化。

細(xì)胞體外生長(zhǎng)活性檢測(cè)

采用溴化二甲噻唑二苯四氮唑(MTT)比色法，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Raji細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將不同濃度的姜黃素6.25-50 μmol/L加入10% FCS的RPMI 1640完全培養(yǎng)液中，調(diào)細(xì)胞濃度為5×105/ml，接種于96孔板，每種藥物濃度為一組，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行孔，置5% CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)不同時(shí)間(0、6、12、24及48小時(shí))后，每孔加MTT 20 μl，培養(yǎng)4小時(shí)，棄MTT，每孔加二甲亞砜150 μl，充分溶解。選擇490 nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔A值。腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組平均A值/對(duì)照組平均A值）×100%。

細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞儀檢測(cè)

用Annexin-V-FITC及PI雙標(biāo)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，分為實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組。分別加入終濃度為6.25-25 μmol/L的姜黃素作用于24小時(shí)，用70%乙醇4℃固定24小時(shí)，PBS緩沖液洗去固定液，離心去上清。用緩沖液37℃孵育60分鐘，195 μl細(xì)胞懸液加5 μl Annexin-V-FITC?；靹?，室溫放置10分鐘。用緩沖液洗滌細(xì)胞1次，在190 μl緩沖液重懸，然后再加10 μl 20 μg碘化丙錠。上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

p300及HDAC1 mRNA表達(dá)的RT-PCR檢測(cè)

細(xì)胞總RNA抽提及RT-PCR　步驟按TrizoL (Gibco公司)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，所提取的總RNA溶解后用紫外分光光度儀測(cè)RNA純度和濃度(A260/A280>1.8)。在GenBank檢索基因cDNA序列，自行設(shè)計(jì)PCR引物，由上海生物工程公司合成。p300引物序列(上游引物: 5′-GGGCTCAACCGACAA GAC-3′，下游引物: 5′-GGAGGCAGAGGCAATCAA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為259 bp。β-actin引物序列上游引物:5′-TGAGACCTTCAACACCCCAG-3′；下游引物: 5′-GCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為312 bp。PCR擴(kuò)增條件為：94℃ 30秒，94℃ 變性1分鐘，57℃復(fù)性 30秒，72℃ 50秒，72℃延伸10分鐘，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。HDAC1引物序列(上游引物: 5′-AGTGCGGTGGTCTTACA GTG-3′，下游引物: 5′-TCTCCCTCCTCTTCAGAATCG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為500 bp。β-actin上游引物:5′-TGAGACCTTCAACACCCCAG3-′；下游引物: 5′-GCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為316 bp。PCR擴(kuò)增條件為：94℃ 5分鐘，94℃ 變性1分鐘，50℃復(fù)性 1分鐘，72℃ 延伸1分鐘，共進(jìn)行32個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物用1%的瓊脂糖膠，進(jìn)行檢測(cè)。用數(shù)碼凝膠圖象分析系統(tǒng)（Kodak EDAS290）作條帶密度掃描，結(jié)果以目的條帶與對(duì)應(yīng)的β-actin密度值表示。

轉(zhuǎn)貼于

細(xì)胞蛋白質(zhì)樣品制備及蛋白定量

經(jīng)處理后的細(xì)胞立即棄去培養(yǎng)液，洗滌，離心。加預(yù)冷的細(xì)胞裂解液(0.1 mol/L NaCl，0.01 mol/L Tris HCl，pH 7.6，0.001 mol/L EDTA，100 μg/ml PMSF，2 μg/ml leupeptin) 0.1 ml，裂解30分鐘，然后10 000×g離心10分鐘，取上清備用。以上所有操作均在4℃下進(jìn)行。測(cè)定蛋白，并調(diào)各組蛋白濃度一致。

Western blot檢測(cè)

按文獻(xiàn)[5］報(bào)道的Western blot方法檢測(cè)p300，HDAC1其中一抗為鼠抗，二抗用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗鼠IgG，經(jīng)化學(xué)發(fā)光法，X線曝光顯影，軟件進(jìn)行掃描定量，每個(gè)濃度組重復(fù)3次，取均值代表測(cè)定結(jié)果。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用Excel 2000軟件作方差分析和t檢驗(yàn)。

結(jié)果

Raji細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的測(cè)定

姜黃素以時(shí)間劑量依賴性方式抑制Raji細(xì)胞增殖，6、12、24和48小時(shí)后，細(xì)胞抑制率分別如下：6.25 μmol/L時(shí)為(1.25±0.7)%、(6.79±0.9)%、(18.25±1.0)%、(23.15±1.9)%；12.5 μmol/L時(shí)為(4.28±0.6)%、(15.24±1.4)%、(30.25±2.0)%、(40.12±1.0)%；25 μmol/L時(shí)為(10.25±1.1)%、(29.14±2.3)%、(51.25±2.8)%、(63.58±2.9)%；50 μmol/L時(shí)為(17.25±2.0)%、(45.78±2.7)%、（63.58±3.5)%、(78.63±3.6)%，差異有顯著性意義(P

Raji細(xì)胞凋亡率的變化

細(xì)胞凋亡率隨姜黃素濃度增高而逐漸增加，兩種濃度（12.5和25 μmol/L）的藥物與對(duì)照組比較均能明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(P0.05)（附表）。Table. Apoptosis ratio of Raji cells (%) inducted by various concentration of curcumin at 24 hours（略）

姜黃素對(duì)Raji細(xì)胞p300及HDAC1 mRNA表達(dá)的影響

姜黃素IC50濃度時(shí)，光密度掃描顯示第6小時(shí)的HDAC1和p300 mRNA表達(dá)已經(jīng)下降，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，表達(dá)逐漸降低，呈時(shí)間依賴性（圖2）。

姜黃素對(duì)Raji細(xì)胞p300及HDAC1蛋白表達(dá)的影響

姜黃素IC50濃度處理Raji細(xì)胞6小時(shí)后p300和HDAC1蛋白表達(dá)開(kāi)始下降，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)呈時(shí)間依賴性降低(圖3)。

討 論

姜黃素(curcumin，cur) 系從中藥姜黃中提取的酚性色素，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、降血脂等廣泛的藥理作用，最近美國(guó)國(guó)立腫瘤所(NCI)將其列為第三代防癌藥物，進(jìn)行臨床研究。大量資料證明，姜黃素能直接抑制腫瘤細(xì)胞的長(zhǎng)，并能誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，其作用機(jī)制主要是調(diào)控癌基因和抑癌基因［6，7］。此外，姜黃素還能抑制人類免疫缺陷病毒Ⅰ型和細(xì)胞有絲分裂的產(chǎn)生及抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和AP-1的活性［8］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)研究姜黃素的抗腫瘤的機(jī)制，結(jié)果表明姜黃素能有效抑制Raji細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，且呈明顯的量效關(guān)系和時(shí)間依賴性，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［9］。

p300是一種具有組蛋白乙?；富钚缘霓D(zhuǎn)錄因子，對(duì)重要生物功能如細(xì)周期調(diào)控、細(xì)胞分化、凋亡等具有重要作用［10］。p300的一個(gè)特征是具有HAT的活性，通過(guò)募集p300相關(guān)輔助因子(PCAF)對(duì)靶組蛋白進(jìn)行乙?；?，多種轉(zhuǎn)錄因子的乙?；{(diào)節(jié)都與p300有關(guān)。Xiao等［11］發(fā)現(xiàn)，p300是HDAC抑制劑TSA誘導(dǎo)和SP1介導(dǎo)的P21WAF1轉(zhuǎn)錄所必需的，p300共轉(zhuǎn)染可升高P21WAF1啟動(dòng)子活化，而且可以導(dǎo)致P21WAF1相關(guān)蛋白H3和H4高乙?；?。研究表明，在急性白血病、乳腺癌、肝癌和直腸癌中p300可發(fā)生多種形式的基因變異［3］。姜黃素作為一種新型、低效的抗癌藥物，作用于生物體細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的p300的表達(dá)水平如何變化？本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，姜黃素 IC50濃度以時(shí)間依賴作用抑制Raji細(xì)胞p300的表達(dá)，最早在12小時(shí)時(shí)即顯示對(duì)p300的抑制作用，48小時(shí)時(shí)抑制水平最高。RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，p300 mRNA和蛋白水平顯著下降，提示姜黃素可能是通過(guò)下調(diào)p300 mRNA的表達(dá)及阻斷其蛋白產(chǎn)物抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡細(xì)胞，其發(fā)生的機(jī)制可能是通過(guò)阻斷p300的轉(zhuǎn)錄激活，降低誘導(dǎo)基因表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。

組蛋白乙?；?去乙?；揎検腔蜣D(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵機(jī)制之一。真核細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)組蛋白乙酰化酶(histone acetylase，HAT)和組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC1)活性的平衡調(diào)控核小體核心組蛋白的乙酰化水平及相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄活性。HAT/ HDAC1活性紊亂則會(huì)使基因表達(dá)失控，從而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。白血病細(xì)胞中由于染色體異位募集HDAC，導(dǎo)致不適當(dāng)?shù)慕M蛋白去乙?；够虮磉_(dá)受抑和白血病發(fā)生［12］。有研究表明，急性白血病細(xì)胞染色體移位產(chǎn)生融合基因PML-RARα和AML-ETO，兩者編碼產(chǎn)生的融合蛋白可以募集HDAC，抑制分化基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，細(xì)胞分化成熟受阻，導(dǎo)致惡性增殖。維甲酸誘導(dǎo)急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞分化時(shí)，可以使HDAC1從被募集位點(diǎn)解離，沉默基因得以表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞分化。抑制HDAC活性，也抑制了組蛋白的去乙酰化作用，核小體組蛋白乙?；缴撸旧w結(jié)構(gòu)松弛有利于轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合，基因表達(dá)增強(qiáng)［13］。有研究表明，HDAC1可通過(guò)抑制hTERT mRNA的表達(dá)來(lái)下調(diào)端粒酶的活性，而端粒酶的活性與腫瘤細(xì)胞的永生化密切相關(guān)，進(jìn)而證明HDAC1在腫瘤細(xì)胞中存在高表達(dá)［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素IC50濃度作用Raji細(xì)胞12小時(shí)可見(jiàn)HDAC1 mRNA及蛋白水平降低，而且持續(xù)48小時(shí)以上，說(shuō)明組蛋白的去乙?；玫阶柚?，可能是組蛋白乙?；街苯佑绊懩[瘤的進(jìn)程，而姜黃素可以誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)停滯和分化，進(jìn)而證明了組蛋白去乙酰化在腫瘤發(fā)生預(yù)防中的作用。這提示姜黃素抑制HDAC1的表達(dá)可能導(dǎo)致體內(nèi)許多細(xì)胞增殖關(guān)鍵性基因轉(zhuǎn)錄降低。

本研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠抑制p300及HDAC1的表達(dá)，而且呈時(shí)間依賴性，說(shuō)明姜黃素是通過(guò)多種途徑抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)分化和凋亡的。因此，我們認(rèn)為姜黃素可以通過(guò)抑制p300及HDAC1活性，誘導(dǎo)組蛋白高乙?；?，調(diào)節(jié)基因表達(dá)，從而發(fā)揮抗癌效應(yīng)，是一種新型抗腫瘤治療的新的分子靶向藥物。

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