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本文作者：張?jiān)郊?秦盛1卞光凱1費(fèi)世明2李欽1曹成亮1王樂(lè)輝2蔣繼宏1

作者單位：1.江蘇師范大學(xué)2.四川省林業(yè)科學(xué)研究院

麻瘋樹(JatrophacurcasL.)是耐旱而非食用型的油種子植物,很容易適應(yīng)半干旱土壤和荒地,因此麻瘋樹被認(rèn)為是潛在的可替代能源植物。在印度,麻瘋樹已晉升為該國(guó)的生物柴油資源[1]。此外,麻瘋樹也是重要的藥用植物,其代謝產(chǎn)物具有抗病毒、抗腫瘤等藥用價(jià)值。然而麻瘋樹抗寒能力較弱,因而在高海拔寒冷地區(qū)以及我國(guó)中東部的栽培與引種受到了限制。另外,近年來(lái)我國(guó)南方常遭遇連續(xù)降雪、冰凍、干旱等惡劣天氣,使得麻瘋樹生長(zhǎng)也面臨著如何有效提高幼苗的抗寒性、抗干旱能力的嚴(yán)峻問(wèn)題。因此,如何提高該物種在低溫、干旱環(huán)境的適應(yīng)性及其初期幼苗活力,建立良好的生長(zhǎng)體系,已成為綜合開發(fā)該資源必須解決的問(wèn)題和實(shí)現(xiàn)麻瘋樹各種生物價(jià)值的重要途徑。植物根際促生菌(Plantgrowth-promotingrhizobacteria,pgpr)是指生存于植物根際、根表,并能間接或直接地促進(jìn)或調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)的微生物[2]。PGPR能夠通過(guò)協(xié)助植物從環(huán)境中攝取養(yǎng)分來(lái)進(jìn)行直接的促生作用;也能夠降低惡劣環(huán)境給植物造成的傷害而間接地產(chǎn)生促生作用。盡管PGPR的促生機(jī)制還沒(méi)有完全弄清楚,但是它多樣的促生作用已被廣泛接受。其促生機(jī)制主要包括:(1)產(chǎn)生調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)的信號(hào)物質(zhì),如赤霉素、吲哚乙酸、細(xì)胞分裂素和乙烯;(2)非共生固氮;(3)產(chǎn)嗜鐵素、抗生素和氰化物抵抗病原菌;(4)溶解磷礦物及其它養(yǎng)分[3]。一些PGPR也能通過(guò)影響共生固氮結(jié)瘤、結(jié)節(jié)促進(jìn)植物生長(zhǎng)[4]。另外已有的研究表明[5],存在于植物根際土壤并能產(chǎn)生1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(1-Aminocyclopropane-1-carboxylate,ACC)脫氨酶的天然細(xì)菌可以把乙烯合成的前體ACC水解成氨和α-丁酮酸,并將這兩種分解產(chǎn)物分別作為N源和C加以利用,從而降低應(yīng)激乙烯的含量,減輕逆境脅迫對(duì)植物造成的傷害,促進(jìn)植物生長(zhǎng)。因此,以ACC脫氨酶為主要指標(biāo)來(lái)篩選根際促生菌用以提高植物對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)性是個(gè)很好的切入點(diǎn),具有較好的應(yīng)用前景。目前,對(duì)麻瘋樹的研究多集中于對(duì)其資源分布、化學(xué)成分、生物柴油轉(zhuǎn)化技術(shù)、生理脅迫、良種選育和繁殖技術(shù)等方面,而麻瘋樹根際具有ACC脫氨酶活性促生菌的研究國(guó)內(nèi)外還未見報(bào)道。本文通過(guò)對(duì)麻瘋樹根際細(xì)菌的分離以及對(duì)菌株進(jìn)行促生指標(biāo)的篩選,尋找有潛在促生作用的菌株,為后續(xù)微生物提高麻瘋樹抗寒、抗干旱能力的研究提供菌種資源,并為植物-根際促生菌的進(jìn)一步深入研究打下前期基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品來(lái)源:樣品采自四川省攀枝花市延邊縣麻瘋樹種植基地,野生麻瘋樹根部及其根際土壤一并帶回處理。

1.1.2培養(yǎng)基:細(xì)菌分離培養(yǎng)基:營(yíng)養(yǎng)瓊脂(NA)、LB培養(yǎng)基、TSA培養(yǎng)基、蔗糖無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(YN)、R2A培養(yǎng)基、KMB培養(yǎng)基、1/4ISP2培養(yǎng)基及改良后的BPA培養(yǎng)基(加入200mL根際土壤浸提液)。促生篩選培養(yǎng)基:有氮培養(yǎng)基、無(wú)氮培養(yǎng)基、SM培養(yǎng)液、無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[6]配制。以上培養(yǎng)基配好后置于1×105Pa滅菌20min。SMA培養(yǎng)基:向SM培養(yǎng)基中添加經(jīng)濾器過(guò)濾除菌的1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC),使其終濃度為3mmol/L。

1.1.3主要試劑及儀器:ACC購(gòu)自Sigma公司,Taq酶及pMD-18T連接試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司,16SrRNA基因擴(kuò)增引物由上海生工生物工程公司公司合成;SpectromaxM2多功能全自動(dòng)定量繪圖酶標(biāo)儀(美國(guó)MolecularDevices),PTC200梯度PCR儀(美國(guó)MJR．I),凝膠成像儀,冷凍離心機(jī)。

1.2根際土壤中細(xì)菌的分離

稱取1g土樣于滅菌的50mL錐形瓶中,加入4mL滅菌水,超聲(150W)15min使泥土分散,之后振蕩將其混勻。取溶液于1.5mL離心管中再分別稀釋102、103、104、105和106。從其中各吸取100μL于LB平板上涂布均勻。置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)35d。待平板上出現(xiàn)較多單菌落時(shí),在無(wú)菌條件下挑取菌落顏色、形態(tài)等培養(yǎng)性狀不同的單菌落分別接種于LB斜面上保存。

1.3根際細(xì)菌促生活性的篩選

1.3.1產(chǎn)ACC脫氨酶能力的測(cè)定:(1)定性測(cè)定:菌株接種于SMA固體培養(yǎng)基,選取傳代5次后能夠在唯一氮源為ACC的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌株為產(chǎn)ACC脫氨酶陽(yáng)性菌株。(2)定量測(cè)定:菌株在LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h,將所獲得的培養(yǎng)物在4°C下以8000r/min離心10min,之后收集菌體,用SM培養(yǎng)液洗滌離心2次,菌體懸浮于SMA培養(yǎng)液,在28°C旋轉(zhuǎn)搖床180r/min的條件下培養(yǎng)24h,以誘導(dǎo)產(chǎn)生ACC脫氨酶。4°C離心收集菌體,用0.1mol/LTris-HCl緩沖液(pH7.6)洗滌離心2次,重新懸浮于600μL0.1mol/LTris-HCl緩沖液中(pH8.5),然后加入30μL甲苯并迅速振蕩30s以破碎細(xì)胞。ACC脫氨酶活性的測(cè)定方法參照Honma[7]和Saleh[8]的方法,于540nm下測(cè)定其OD值。ACC脫氨酶的單位酶活為在測(cè)酶體系中以1μmol/min的速率形成α-丁酮酸的活性。蛋白質(zhì)測(cè)定采用Bradford比色法[9],以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算得到線性方程。ACC脫氨酶酶活單位為μmolα-KA/(mg•h),各菌株酶活性測(cè)定均扣除樣品對(duì)照中自發(fā)產(chǎn)物后計(jì)算。

1.3.2產(chǎn)生長(zhǎng)素(IAA)能力的測(cè)定:(1)定性測(cè)定:向含有氮元素培養(yǎng)液中添加除菌后的色氨酸溶液,使色氨酸濃度最終達(dá)到0.5g/L。挑取菌株接種于上述培養(yǎng)液中,37°C搖床培養(yǎng)24h,用無(wú)菌槍頭吸取1mL菌液于無(wú)菌離心管中,加入2mLSackowcki’s顯色劑[10]之后迅速充分混合,室溫下避光顯色20min。出現(xiàn)粉紅色為陽(yáng)性,說(shuō)明有IAA產(chǎn)生。(2)定量測(cè)定:陽(yáng)性菌株避光放置30min,測(cè)定其OD530值。通過(guò)IAA濃度與OD530的線性方程計(jì)算相應(yīng)的IAA濃度,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。各菌株IAA含量測(cè)定均扣除樣品對(duì)照中自發(fā)產(chǎn)物后計(jì)算。

1.3.3固氮能力測(cè)定:將菌株接種于無(wú)氮培養(yǎng)基,37°C培養(yǎng)38d觀察其生長(zhǎng)情況,轉(zhuǎn)接5次。

1.3.4解磷能力測(cè)定:將菌株接種于無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基,37°C培養(yǎng)38d,觀察有無(wú)溶磷圈。1.3.5產(chǎn)鐵載體能力測(cè)定:將菌株接種于CAS檢測(cè)培養(yǎng)基,37°C培養(yǎng)23d,觀察培養(yǎng)基上有無(wú)形成橙色鐵載體分泌圈[11]。

1.4根際細(xì)菌16SrRNA基因序列的測(cè)定以及系統(tǒng)發(fā)育分析

分離菌株總DNA的提取參照文獻(xiàn)[12]的方法進(jìn)行;PCR擴(kuò)增采用細(xì)菌16SrRNA通用引物[13],27f:5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′;1492r:5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′。PCR反應(yīng)條件為:94°C5min;95°C1min,55°C1min,72°C90s,共35個(gè)循環(huán);72°C10min。PCR產(chǎn)物用經(jīng)EB染色的0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后測(cè)序。依照測(cè)序結(jié)果,從NCBI(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)和EzTaxon()數(shù)據(jù)庫(kù)中調(diào)出相似性較高的相關(guān)菌株16SrRNA基因序列,分別用ClustalX2.0及MEGA5.0[14]軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析,最后用鄰接法(Neighbor-Joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,并做系統(tǒng)發(fā)育分析。

2結(jié)果與分析

2.1土壤根際細(xì)菌的分離

在NA、LB、TSA、YN、R2A、改良后的BPA、KMB及1/4ISP2這8種培養(yǎng)基上涂布混合的土壤懸液,共分離得到98株細(xì)菌,根據(jù)菌落顏色、形態(tài)、大小等特征初步去重復(fù)后獲得28株細(xì)菌,繼而對(duì)這28株細(xì)菌進(jìn)行促生潛在性評(píng)價(jià)。

2.2內(nèi)生細(xì)菌的促生長(zhǎng)潛力

從表1中可以看出,28株供試菌株中有15株具有固氮的能力,占總菌株的54%;9株具有解磷的能力,占總菌株的32%;僅有2個(gè)菌株能產(chǎn)生鐵載體,占總菌株的7%;有19株菌可以產(chǎn)生IAA(68%),其中KLBMP4820、KLBMP4806、KLBMP4807及KLBMP4804產(chǎn)IAA的含量分別高達(dá)57.063±0.016、50.811±0.001、54.467±0.017及50.439±0.015mg/L。在之前的ACC脫氨酶活性定性篩選中,經(jīng)5次傳代后有13株(46%)細(xì)菌仍能夠在SMA固體培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng),這說(shuō)明他們具有ACC脫氨酶活性。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,當(dāng)ACC脫氨酶酶活不低于20nmolα-KA/(mg•h)時(shí),就可促進(jìn)植物的生長(zhǎng)[15]。通過(guò)進(jìn)一步的定量檢測(cè)顯示,13株菌的ACC脫氨酶酶活均高于20nmolα-KA/(mg•h)。而菌株KLBMP4801、KLBMP4828、KLBMP4803、KLBMP4802以及KLBMP4806和KLBMP4804的ACC脫氨酶酶活較高,最高達(dá)到128.308±0.577μmolα-KA/(mg•h)。另外KLBMP4801、KLBMP4802、KLBMP4804、KLBMP4806、KLBMP4821,KLBMP4826和KLBMP4828這幾株菌同時(shí)具有產(chǎn)ACC脫氨酶及IAA的能力,且與之前一些研究相比,IAA含量和ACC脫氨酶含量都有所上升。值得關(guān)注的是,本研究獲得的KLBMP4821菌株屬于窄食單胞菌屬,而有研究表明,該屬的大部分細(xì)菌能夠在宿主植物中定殖并對(duì)植物具有促生等有益作用[16]。KLBMP4803、KLBMP4808和KLBMP4810這幾株菌也有較高的ACC脫氨酶酶活,但并無(wú)產(chǎn)IAA的能力。而KLBMP4807、KLBMP4820和KLBMP4827等幾株菌產(chǎn)IAA的含量較高,卻不具備產(chǎn)ACC脫氨酶的能力。綜合幾個(gè)促生指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果:獲得了幾株同時(shí)具備多個(gè)促生指標(biāo)的菌株以及一些僅具單一促生指標(biāo)能力但含量較高的菌株。由此推斷,四川省麻瘋樹根際土壤中應(yīng)該擁有較多具有潛在促生長(zhǎng)作用的細(xì)菌,而這些菌株也有一定的研究?jī)r(jià)值。

2.3根際細(xì)菌16SrRNA基因序列的測(cè)定以及系統(tǒng)發(fā)育分析

從麻瘋樹根際土壤中分離后經(jīng)促生指標(biāo)初步篩選出的22株細(xì)菌(其中6株屬于經(jīng)典產(chǎn)絲放線菌,待進(jìn)一步單獨(dú)研究,因此不在本文中列出),以提取的總DNA為模板,擴(kuò)增得到16SrRNA基因序列。結(jié)果顯示,它們屬于Firmicutes門,Proteobacteria門和Actinobacteria門的三大系統(tǒng)發(fā)育類群(表2)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)共8個(gè)屬,其中有11株屬于芽孢桿菌屬(Bacillus),為分離菌株總數(shù)的50%,占主要地位。而其中的KLBMP4802、KLBMP4804以及KLBMP4820均為產(chǎn)ACC脫氨酶或IAA較高的菌株。KLBMP4806和KLBMP4816屬于糞產(chǎn)堿桿菌屬(Advenella);KLBMP4814和KLBMP4810兩株菌屬于節(jié)桿菌屬(Arthrobacter);KLBMP4821屬于窄食單胞菌屬(Stenotrophomonas);KLBMP4826和KLBMP4829屬于假單胞菌屬(Pseudomonas);KLBMP4803屬于西地西菌屬(Cedecea);KLBMP4827屬于產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)。而KLBMP4817和KLBMP4824屬于類芽孢桿菌屬(Paenibacillus),這也充分顯示了四川麻瘋樹根際細(xì)菌的豐富多樣性。經(jīng)MEGA5構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)進(jìn)化樹分析(圖1)以及在EzTaxon數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行有效種的16SrRNA基因序列相似性搜索后發(fā)現(xiàn),其中KLBMP4817(1462bp)與該屬的典型菌株相似性低于98%,與最近的標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)aenibacillusfonticolaZLT相似性為97.8%,在系統(tǒng)發(fā)育樹中(圖2)又獨(dú)立成一進(jìn)化分支并且有較高的自舉值,可能為潛在的新種。而與KLBMP4821(1454bp)的16SrRNA基因相似性高于97%的菌有6株,但從系統(tǒng)進(jìn)化樹上來(lái)看(圖3),KLBMP4821只與Stenotrophomonaschelatiphaga(EU573216)、Stenotrophomonaspavanii(FJ748683)以及Stenotrophomonasmaltophilia(AB008509)同聚在一個(gè)大分支上,并有較高的自舉值。同樣,KLBMP4824(1455bp)與Paenibacillusgly-canilyticus(AB042938)以及Paenibacillusxinji-angensis(AY839868)聚在系統(tǒng)發(fā)育樹的一個(gè)分支上(圖4),而KLBMP4824與這兩株菌的相似性分別為98.7%和97.0%。另外,經(jīng)由對(duì)菌株KLBMP4817、KLBMP4821和KLBMP4824的表型及生理生化特征與各自相關(guān)的典型菌株之間的比較分析,均存在較大差異性,因此我們初步認(rèn)為它們代表Stenotrophomonas和Paenibacillus屬的新種,但要最終確定它們的分類地位,仍需綜合各自形態(tài)特征、生理生化與化學(xué)分類特征以及與最近菌株的DNA-DNA同源性分析結(jié)果來(lái)判斷,而我們也正同時(shí)進(jìn)行這些新種鑒定工作的研究,相關(guān)文章將在后期發(fā)表。

3討論

目前國(guó)內(nèi)對(duì)麻瘋樹已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究,通過(guò)對(duì)種植資源分布的調(diào)查,基本摸清了麻瘋樹的種植和分布地帶,在此基礎(chǔ)之上,建立了生物物質(zhì)能源植物數(shù)據(jù)庫(kù)。但是,麻瘋樹目前只自然分布于我國(guó)的熱帶和亞熱帶地區(qū),分布范圍比較有限;雖然麻瘋樹幼苗對(duì)鹽脅迫、干旱脅迫以及低溫脅迫具有一定的抗逆性,但要想在我國(guó)其它地區(qū)大面積推廣栽培,就必須進(jìn)一步加以研究以提高其抗逆性[17]。

研究發(fā)現(xiàn),植物根際促生菌(PGPR)通常可以通過(guò)直接和間接兩種方式來(lái)促進(jìn)植物的生長(zhǎng)和發(fā)育[18]。此外,PGPR還能夠提高植物耐非生物脅迫的能力(如鹽脅迫和干旱脅迫等)[19]。同時(shí)研究表明,ACC脫氨酶被認(rèn)為能降低植物乙烯的濃度,是PGPR促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育的主要機(jī)制之一。迄今為止,國(guó)內(nèi)外已有許多科研人員報(bào)道了具ACC脫氨酶活性的植物根際促生菌能提高植物的抗極端溫度脅迫和土壤pH脅迫[20],抗水澇脅迫,抗重金屬脅迫,能夠增加植物在鹽堿環(huán)境中的成活率,延長(zhǎng)水果保質(zhì)期,有效防止病原菌對(duì)植物的傷害等[21]。本文首次對(duì)麻瘋樹根際具有ACC脫氨酶活性的菌株進(jìn)行了分離篩選,發(fā)現(xiàn)在28株供試菌株中,46%的菌株能產(chǎn)生ACC脫氨酶,有54%的菌株具有固氮能力;32%的菌株具有解磷能力;68%的菌株能產(chǎn)生IAA;其中有13株菌株的ACC脫氨酶酶活超過(guò)了20nmolα-KA/(mg•h),最高含量達(dá)到128μmolα-KA/(mg•h)。比滕松山[22]報(bào)道中的ACC脫氨酶活性以及吉秀云[23]報(bào)道的IAA及ACC脫氨酶活性均有較大幅度的提升。

目前,已報(bào)道的具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的細(xì)菌主要包括:芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、微桿菌屬(Microbacterium)、微小桿菌屬(Exiguobacterium)、弧菌屬(Vibrio)、窄食單胞菌屬(Stenotrophomonas)和腸桿菌屬(Enterobacter)[5,15,2427]等。在本文的研究中,綜合ACC脫氨酶、IAA、固氮、解磷、產(chǎn)鐵載體等5個(gè)指標(biāo)及經(jīng)16SrRNA基因序列分析發(fā)現(xiàn),芽孢桿菌屬的菌株KLBMP4802、KLBMP4809、KLBMP4804,窄食單胞菌屬的KLBMP4821等都具有較強(qiáng)的潛在促生作用,這與之前的有關(guān)研究相符;然而本研究得到的糞產(chǎn)堿桿菌屬的菌株KLBMP4806和KLBMP4816,節(jié)桿菌屬的KLBMP4810、KLBMP4814等也具有較強(qiáng)的促生長(zhǎng)潛在性,這也擴(kuò)大了已知的具有潛在促生長(zhǎng)作用的細(xì)菌種屬范圍。本實(shí)驗(yàn)室也同時(shí)運(yùn)用富集定向篩選法篩選出具有ACC脫氨酶活性的菌株,但這些菌株的實(shí)際促生作用究竟如何,仍需通過(guò)進(jìn)一步的盆栽試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。

綜上所述,四川省攀枝花市麻瘋樹基地土壤中不僅含有大量的細(xì)菌資源,而且具有豐富的多樣性,其中不乏高促生作用的細(xì)菌類群,這不僅為我們?nèi)蘸笱芯繉?duì)麻瘋樹有促生作用的菌株的回接提供了很好的材料,也為研究微生物對(duì)麻瘋樹的抗寒、抗旱、促生、抗病蟲、快繁等方面提供了良好的資源。