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本文作者：鄭桂玲1周洪旭1耿以龍2杜方嶺3王未名3李長(zhǎng)友1作者單位：1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與植物保護(hù)學(xué)院2.青島市森林病蟲(chóng)害防治工作站3.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院原子能農(nóng)業(yè)應(yīng)用研究所

美國(guó)白蛾屬鱗翅目燈蛾科，是一種世界性的檢疫害蟲(chóng)，原產(chǎn)于北美，1979年傳入我國(guó)，其寄主范圍廣泛，喜食的植物主要有桑、白蠟、法桐、臭椿、榆、楊、柳等，其成蟲(chóng)產(chǎn)卵量大，幼蟲(chóng)具有暴食性，對(duì)我國(guó)林業(yè)和園林綠化造成嚴(yán)重?fù)p失。對(duì)美國(guó)白蛾采取安全有效并與環(huán)境友好的生物防治措施非常重要［1］，美國(guó)白蛾核型多角體病毒(hcnpv)對(duì)防治美國(guó)白蛾幼蟲(chóng)具有高效、專(zhuān)一和安全等優(yōu)點(diǎn)，可有效降低化學(xué)藥劑對(duì)環(huán)境的污染，可以大面積應(yīng)用［2－4］。但病毒作為殺蟲(chóng)劑在應(yīng)用之前，首先要解決大量增殖問(wèn)題。目前，采用活蟲(chóng)體進(jìn)行增殖依然是獲得大量病毒的主要途徑［5］，蟲(chóng)齡和接種濃度(劑量)是影響病毒大量增殖的主要因素［6－7］。2008年作者從青島市郊區(qū)美國(guó)白蛾病死幼蟲(chóng)體內(nèi)分離了1株美國(guó)白蛾核型多角體病毒，作者對(duì)幼蟲(chóng)齡期、接種劑量及其組合對(duì)該HcNPV產(chǎn)量的影響進(jìn)行了研究，篩選出適合大量增殖的最佳條件，以期為該病毒的大量增殖和病毒殺蟲(chóng)劑的生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1．1材料

美國(guó)白蛾采集于青島市城陽(yáng)區(qū)，在室內(nèi)用人工飼料連續(xù)飼養(yǎng)，選取大小一致的健康幼蟲(chóng)，供試驗(yàn)用。美國(guó)白蛾人工飼料參照隋賀等的配方［8］。美國(guó)白蛾核型多角體病毒為本室2008年從青島市城陽(yáng)區(qū)病死的美國(guó)白蛾幼蟲(chóng)體內(nèi)分離的毒株。

1.2方法

1.2.1病毒的提取和病毒懸液的制備

用4齡美國(guó)白蛾幼蟲(chóng)增殖HcNPV青島分離株，收集病毒致死幼蟲(chóng)。用0.2%次氯酸鈉消毒幼蟲(chóng)5min，滅菌水沖洗2遍，加入滅菌水，將死蟲(chóng)用研磨器研磨勻漿，稀釋后3層紗布過(guò)濾。病毒提取采用差數(shù)離心法，濾液經(jīng)500r/min離心15min，棄沉淀，上清液采用5000r/min離心20min，如此重復(fù)3次，獲得病毒多角體懸液，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)測(cè)得病毒濃度，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2飼毒和飼養(yǎng)方法

設(shè)飼毒蟲(chóng)齡分別為4，5，6齡;飼毒劑量分別為1.48×106，1.48×105，1.48×104，1.48×103，1.48×102OBs/頭，共15個(gè)處理。將人工飼料切割成5mm2的小片，放入24孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔1塊，取HcNPV分別稀釋成1.48×108，1.48×107，1.48×106，1.48×105，1.48×104OBs/mL，每塊飼料滴加以上各濃度病毒液10μL，以滴加滅菌水作為對(duì)照，分別飼喂4，5，6齡美國(guó)白蛾幼蟲(chóng)，24h后選取吃光飼料的幼蟲(chóng)放入養(yǎng)蟲(chóng)盒內(nèi)，每盒15頭，每處理30頭幼蟲(chóng)，3次重復(fù)，每天檢查并更換新鮮人工飼料，待幼蟲(chóng)發(fā)病后鏡檢，每天觀察2次，將不同處理的病死蟲(chóng)分別收集，并記錄死蟲(chóng)數(shù)量，直到幼蟲(chóng)化蛹為止。

1.2.3病毒產(chǎn)量測(cè)定

將每一處理的病死蟲(chóng)分別用研磨器研磨勻漿，稀釋后3層紗布過(guò)濾，濾液采用5000r/min離心20min沉淀病毒，用無(wú)菌水懸浮后定容稀釋?zhuān)醚蛴?jì)數(shù)板計(jì)數(shù)測(cè)得病毒濃度，根據(jù)稀釋倍數(shù)、定容體積和死蟲(chóng)數(shù)計(jì)算平均單頭幼蟲(chóng)的病毒產(chǎn)量，同時(shí)根據(jù)幼蟲(chóng)死亡率計(jì)算百頭幼蟲(chóng)的病毒總產(chǎn)量，病毒總產(chǎn)量的計(jì)算方法為單頭幼蟲(chóng)病毒產(chǎn)量×死亡率(%)×100。

1.2.4數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用DPS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果與分析

2.1蟲(chóng)齡、病毒劑量及其組合對(duì)單頭幼蟲(chóng)病毒產(chǎn)量的影響

測(cè)定了4，5，6齡幼蟲(chóng)分別接種1.48×106，1.48×105，1.48×104，1.48×103，1.48×102OBs/頭劑量時(shí)單頭美國(guó)白蛾幼蟲(chóng)病毒多角體的產(chǎn)量。方差分析(數(shù)據(jù)略)結(jié)果表明，蟲(chóng)齡、劑量以及蟲(chóng)齡與劑量的組合對(duì)單頭幼蟲(chóng)病毒產(chǎn)量的影響均極顯著，其中最主要的影響因子是蟲(chóng)齡，其次是劑量以及蟲(chóng)齡和劑量的組合。單頭幼蟲(chóng)病毒的產(chǎn)量隨著蟲(chóng)齡的增大而明顯增加，接種6齡幼蟲(chóng)的平均單頭幼蟲(chóng)病毒產(chǎn)量最高，其次為5齡幼蟲(chóng)的產(chǎn)量，而4齡幼蟲(chóng)的產(chǎn)量最低，6齡、5齡與4齡幼蟲(chóng)之間差異極顯著，結(jié)果見(jiàn)表1。6齡幼蟲(chóng)病毒產(chǎn)量為4齡幼蟲(chóng)病毒產(chǎn)量的2.99倍，5齡幼蟲(chóng)病毒產(chǎn)量為4齡幼蟲(chóng)的2.67倍，接種病毒時(shí)蟲(chóng)齡越高，蟲(chóng)體越大，單頭幼蟲(chóng)的病毒產(chǎn)量越高。

2.2蟲(chóng)齡、病毒劑量及其組合對(duì)幼蟲(chóng)死亡率的影響

對(duì)蟲(chóng)齡、劑量以及蟲(chóng)齡和劑量的組合影響幼蟲(chóng)死亡率的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明，蟲(chóng)齡、劑量以及蟲(chóng)齡與劑量的組合對(duì)幼蟲(chóng)死亡率的影響均極顯著，其中最主要的影響因子是劑量，其次是蟲(chóng)齡，最后是蟲(chóng)齡和劑量的組合。各齡幼蟲(chóng)的死亡率與劑量呈正相關(guān)，死亡率隨著劑量的增大而增加;在相同劑量下，死亡率與蟲(chóng)齡呈負(fù)相關(guān)，幼蟲(chóng)死亡率隨著蟲(chóng)齡的增大而減小(數(shù)據(jù)見(jiàn)表2)。

2.3蟲(chóng)齡、病毒劑量及其組合對(duì)病毒總產(chǎn)量的影響

對(duì)蟲(chóng)齡、劑量以及蟲(chóng)齡和飼毒劑量的組合影響病毒總產(chǎn)量的情況進(jìn)行的統(tǒng)計(jì)和方差分析顯示，蟲(chóng)齡、劑量以及蟲(chóng)齡與劑量的組合對(duì)病毒總產(chǎn)量的影響均極顯著，其中最主要的影響因子是劑量，其次是蟲(chóng)齡，最后為蟲(chóng)齡和劑量的組合。蟲(chóng)齡和劑量的不同組合對(duì)單頭幼蟲(chóng)的病毒產(chǎn)量以及幼蟲(chóng)死亡率等2個(gè)決定病毒總產(chǎn)量的因素均有影響，進(jìn)而對(duì)病毒總產(chǎn)量產(chǎn)生影響。由表2可見(jiàn)，在室內(nèi)大量增殖HcNPV時(shí)，以1.48×106OBs/頭的劑量飼喂5齡和6齡幼蟲(chóng)均可以獲得最高的病毒產(chǎn)量，百頭幼蟲(chóng)的病毒總產(chǎn)量可分別達(dá)到1.55×1011OBs和1.50×1011OBs。

3結(jié)論與討論

病毒的大量增殖是其作為殺蟲(chóng)劑生產(chǎn)和應(yīng)用的前提，本文對(duì)美國(guó)白蛾核型多角體病毒增殖時(shí)蟲(chóng)齡、接種劑量及其組合的影響進(jìn)行的測(cè)定和分析結(jié)果表明，蟲(chóng)齡、劑量及其組合對(duì)單頭幼蟲(chóng)病毒產(chǎn)量、幼蟲(chóng)死亡率和病毒總產(chǎn)量均具有顯著影響。病毒總產(chǎn)量取決于單頭幼蟲(chóng)病毒產(chǎn)量和死亡率的大小，而單頭幼蟲(chóng)病毒產(chǎn)量和死亡率會(huì)受到蟲(chóng)齡、劑量以及二者的相互作用等影響。單頭幼蟲(chóng)的病毒產(chǎn)量隨著蟲(chóng)齡的增大而增加，而隨著劑量的增加呈降低趨勢(shì);幼蟲(chóng)死亡率則隨劑量的增大而增加，隨蟲(chóng)齡的增大而降低。因此，為獲得最高的病毒總產(chǎn)量，需要綜合分析，篩選用于增殖病毒的最佳蟲(chóng)齡和劑量組合。

本研究表明，在室內(nèi)大量增殖HcNPV時(shí)，以1.48×106OBs/頭的劑量飼喂5齡和6齡幼蟲(chóng)均可以獲得最高的病毒產(chǎn)量，百頭幼蟲(chóng)的病毒總產(chǎn)量可達(dá)到1．55×1011OBs和1．50×1011OBs，而單頭幼蟲(chóng)的病毒產(chǎn)量最高可達(dá)2．319×109OBs，與艾德洪等［2］報(bào)道的用5．5×107PIB/mL的病毒感染4齡美國(guó)白蛾幼蟲(chóng)可獲得最高的多角體收獲量的結(jié)果有所不同，這可能是不同的毒株在殺蟲(chóng)毒力和殺蟲(chóng)速度上的差異引起的。影響病毒增殖產(chǎn)量的最主要因子是飼毒時(shí)的蟲(chóng)齡和劑量(或濃度)［6－7］，此外還有報(bào)道，持續(xù)飼毒時(shí)間、溫度和光照周期等因子也會(huì)不同程度的影響病毒的產(chǎn)量［9］。本文主要對(duì)影響病毒產(chǎn)量的2個(gè)關(guān)鍵因子進(jìn)行了分析，其它因子對(duì)其產(chǎn)量是否產(chǎn)生影響以及影響的大小，有待進(jìn)一步測(cè)定和分析。