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本文作者：雷先德1,2李金文1徐秀玲1,2張翰林1,2曹林奎1作者單位：1.上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院2.農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(南方)開放重點實驗室

長期大量施用化肥、農(nóng)藥,導致土壤板結,易缺氧,土壤酶活性及微生物多樣性降低。近年來,上海都市農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展迅速,尤其是蔬菜生產(chǎn),在實際生產(chǎn)中,大部分菜農(nóng)為了片面追求高產(chǎn)而忽視品質(zhì),大量使用化肥,特別是氮肥的過量施用現(xiàn)象非常普遍。然而,近年來國家統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,我國農(nóng)業(yè)資源消耗,包括化肥、農(nóng)藥等的用量增長速率與農(nóng)業(yè)增產(chǎn)量不呈正比,并導致品質(zhì)下降[14]。相關研究調(diào)查顯示,這些化肥的利用率僅為35%左右,其余未被利用的大部分都變成了污染源,造成水體、空氣和土壤污染等環(huán)境問題[58]。為了解決農(nóng)作物高產(chǎn)與化肥過量施用而引起環(huán)境污染之間這一突出矛盾,農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(南方)開放重點實驗室開展了長期的農(nóng)田污染源頭控制與過程治理的研究工作,并且創(chuàng)新開發(fā)出了一種農(nóng)用功能微生物菌劑。本試驗以該微生物菌劑為試驗材料,應用于葉菜類菠菜,探討化肥減量化技術對菠菜營養(yǎng)吸收利用的影響,研究微生物菌劑對菠菜的促生效應,并應用PCR-DGGE(變性凝膠梯度電泳)等現(xiàn)代分子生物學的手段[89],研究化肥減量與微生物菌劑配施處理方式對土壤微生物種群多樣性的影響,旨在為從源頭控制農(nóng)業(yè)面源污染,保護水源地生態(tài)健康,減少化肥用量,推廣環(huán)保節(jié)能的農(nóng)用混合微生物菌劑提供理論基礎和試驗參考。

1材料與方法

1.1供試材料與試驗設計

供試菠菜品種為河北佳禾種子公司提供的大葉菠菜;供試菌劑由河北省科學院微生物研究所提供的硅酸鹽菌劑和上海交通大學農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(南方)重點開放實驗室分離純化培養(yǎng)的自生固氮菌液,二者進行混合培養(yǎng)而形成的混合菌液。該混合菌液具有溶磷、解鉀及固氮等功能,主要菌株為Paenibacillusmucilaginosus和Bacillussubtilis,有效活菌數(shù)大于2×108cfu•mL1。選用直徑30cm、高30cm的花盆。試驗前每處理每盆等量施用30.55g有機肥,有機肥的有機質(zhì)含量≥400g•kg1,N、P、K含量≥80g•kg1,含N43.6g•kg1,含水率27.55%,pH7.85,Cd含量7.23mg•kg1,Pb含量78.24mg•kg1,Cr含量116.43mg•kg1,As含量54.23mg•kg1。有機肥與土壤拌勻。本試驗共設6個不同處理,每處理設3個重復(見表1)。菠菜定植密度為7株•盆1。試驗所用氮肥為尿素,磷肥為過磷酸鈣,鉀肥為硫酸鉀以及上海雨霖牌生物有機肥料。第1季菠菜從2010年11月20日播種開始,到2011年1月24日收割結束;第2季從2011年3月8日到2011年5月5日。供試土壤采自上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院試驗田,土壤類型為褐壤土,試驗前土壤理化性質(zhì)背景指標測定如下:土壤全氮、有效磷、速效鉀、有機質(zhì)含量分別為1.117g•kg1、0.212mg•kg1、125.00mg•kg1、12.40g•kg1,電導率(Ec值)為1.84mS•cm1,pH為7.25。試驗期間人工澆水,根據(jù)菠菜不同生長期的需要,每1~5d澆水1次。

1.2菠菜測定分析

在第1季菠菜六葉期(2010年12月20日14:00)和營養(yǎng)生長后期(2011年1月24日14:00),每盆隨機抽取3株,挑選每株新長出的成熟葉片,使用SPAD-502儀測定葉綠素含量SPAD1和SPAD2。2011年1月14日下午,用OSI-FL葉綠素熒光儀、經(jīng)暗適應30min后,測定菠菜葉片葉綠素熒光參數(shù),每處理9次重復。2011年1月24日,菠菜收割當天,用紫外分光光度法測定菠菜可食部分硝酸鹽含量,每樣品3次重復。電子天平計量菠菜收割產(chǎn)量,每盆單獨收割測產(chǎn);菠菜N、P、K含量由上海交通大學分析測試中心測定,其中N使用Elementer公司元素分析儀(EAI)測定,P、K使用離子光譜儀(ICP)分析測定,每個樣品3次重復。

1.3土壤樣品采集與處理

試驗期間,分別在菠菜六葉期(2010年12月20日)和營養(yǎng)生長后期(2011年1月24日)兩次采集土樣。使用不銹鋼取土器采集0~15cm土層,部分土壤放于20℃冰箱冷凍保存,另一部分土壤樣品風干后研磨,分別過2mm篩和0.45mm篩,塑料袋封裝保存,待測。

1.4土壤微生物分析

1.4.1土壤總DNA的提取、16SrDNAV3區(qū)片段PCR擴增

每個樣品取0.5g土樣提取DNA,本試驗采用Omega公司生產(chǎn)的soilDNAKit提取土壤微生物基因組DNA,按試劑盒使用說明的操作步驟進行。將純化后的基因組DNA作為聚合酶鏈反應(PCR)的模板。采用微生物16SrDNA基因V3區(qū)具有特異性的引物對F341GC和R517,其序列分別為:（略）。GC夾(下劃線)的目的是為了防止在DGGE過程中,引物的完全分離的擴增。反應體系為50μL,PCR反應采用降落PCR策略,即:預變性條件為96℃5min,前20個循環(huán)為94℃1min,65~55℃1min和72℃3min(其中每個循環(huán)后復性溫度下降0.5℃),后10個循環(huán)為94℃1min,55℃1min和72℃3min,最后在72℃下延伸7min。PCR反應的產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4.2DGGE和染色

采用DcodeTM突變檢測系統(tǒng)(CBS)對16SrDNAV3區(qū)擴增產(chǎn)物進行DGGE分析。使用梯度膠制備裝置,變性劑濃度從30%到60%(100%的變性劑為7mol•L1的尿素和40%的去離子甲酰胺),聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%;在150V的電壓下,上樣量為18μL。其運行條件為:0.5×TAE電泳緩沖液,60℃電泳條件下,150V,10h。電泳完畢后,再用去離子水漂洗,固定15min,染色15min,顯色10min。在圖像處理過程中,對于在DGGE電泳圖上是肉眼可見、但被軟件忽略掉的一些小條帶進行了手動處理,條帶的密度由該軟件自動算出。

1.4.3指紋圖譜的處理與分析

基于PCR-DGGE的基本原理,所擴增的DGGE條帶的數(shù)量可代表群落DNA序列的豐富度(S),群落DNA序列的多樣性可采用Shannon-Weaver指數(shù)及其均勻度指數(shù)來表示,Shannon-Weaver指數(shù)及其均勻度指數(shù)計算公式為:（略）。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel2003及SPSS13.0進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析,用單因素方差分析及鄧肯檢驗(DMRT)對數(shù)據(jù)進行顯著性差異分析。采用Bio-rad公司Quantityone軟件的UPGAMA程序進行微生物群落的聚類分析。

2結果與分析

2.1菌劑處理對菠菜生長特性和產(chǎn)量的影響

2.1.1對菠菜營養(yǎng)狀態(tài)的影響

通過對菠菜葉片葉綠素含量進行測定結果顯示(表2),不同施肥處理間差異明顯。各處理相比,就兩次測定的葉綠素含量的變化,T2、T3、T4、T5處理增幅較大,其中T1增加24.2%,而T5則達到45.6%。最后測定各處理的葉綠素含量差異為:T5>T4>T2>T3>T1>>CK。結果說明,化肥對葉綠素合成量的影響在菠菜生長前期影響更為明顯,且常規(guī)化肥處理(T1)為最大;而在生長后期,隨著微生物菌劑在環(huán)境中的定植與適應,在土壤中繁殖量顯著提高,活性顯著增強,對菠菜的作用逐漸顯現(xiàn),相反,化肥的作用卻呈下降趨勢,從而導致最終化肥減量20%和40%的處理比完全用化肥的葉綠素含量要高?？梢?化肥作為速效性肥料對菠菜生長影響較快,作用時間較短,成本較高;而菌劑與化肥的混施,不但更能提高葉綠素含量,且作用時間長,成本也更低。Fv/Fm指標反映菠菜葉綠素熒光動力學參數(shù),是葉片光合系統(tǒng)II原初光能轉(zhuǎn)換效率,即可變熒光產(chǎn)量與最大熒光產(chǎn)量之比。測定結果顯示,相比對照處理,使用菌劑的T2、T3、T4和T5處理的Fv/Fm都有所提高,其中T3達到0.797,比對照提高0.012,處理間差異顯著。由此可見,菌劑處理的菠菜在營養(yǎng)生長中的光能轉(zhuǎn)化能力優(yōu)于不施肥CK。添加微生物菌劑的處理與純粹使用化肥的T1處理差異不顯著。菠菜對化肥及土壤中N、P、K等養(yǎng)分的吸收直接表現(xiàn)為各元素在植株體內(nèi)的含量。由表2可知,在收割期,各處理間菠菜N含量存在顯著差異。以T2和T3最高,T5和T4次之,CK處理最低,且T2處理較CK處理的增幅為100%。由此可見,菌劑處理后,固氮菌提高了植株N含量,也就是提高了N吸收,減少了N損失。菠菜收割后植株P、K含量以T1處理為最低,分別約為35.3g•kg1和56.5g•kg1,且明顯低于CK的45.8g•kg1和69.9g•kg1,表明在生長后期,T1處理的菠菜對P、K的吸收較少,土壤中有效磷和速效鉀含量低。相比T1處理,T2和T5處理反而有所提高,表明硅酸鹽菌的溶磷、解鉀作用促進了菠菜對P的吸收利用量,使菠菜P含量較純化肥處理的T1要高。微生物菌劑的兩種菌各自發(fā)揮了其主要功能,固氮菌保持了較低氮肥使用條件下的高N含量,硅酸鹽菌確保了較低磷肥和鉀肥使用條件下的高P、K含量。

2.1.2對菠菜硝酸鹽含量的影響

收割后將菠菜全株(包括根、莖、葉)搗碎后測定硝酸鹽含量。由表3可知,與不施肥(CK)處理相比,施肥處理對菠菜硝酸鹽含量影響較大,使硝酸鹽含量顯著增加。其中,T1處理的硝酸鹽增量最為明顯,達到5866.52mg•kg1,T2最小,為4358.23mg•kg1,T3、T4和T5處理在4677.55~5078.25mg•kg1之間。由此可見,T2、T3、T4、T5處理與T1處理相比,硝酸鹽含量明顯降低。因此,菌劑的配合施用與純施化肥相比,可以提高菠菜品質(zhì),有利于生產(chǎn)有機健康蔬菜。

2.1.3對菠菜產(chǎn)量的影響

根系是植物從土壤獲取養(yǎng)分的必要器官,但作為可食用的菠菜,根系重量在菠菜收割期所占總生物量的比重越高(即根生物量比重越高),其可食用部分就相對減少,產(chǎn)量就相對降低。表3表明,固氮溶磷解鉀菌劑配合施用后,與不施肥對照相比,根生物量比重有明顯降低,由4.36%下降到3.02%,降低約30%,比化肥T1處理的3.54%也有降低。由此說明,功能菌劑的配施不僅促進了菠菜根系的生長,而且提高了養(yǎng)分及光合產(chǎn)物的有機分配,從而提高了菠菜可食部分的生物量比重,提高了菠菜產(chǎn)量,有效提高了菠菜的經(jīng)濟效益。本試驗包括兩季菠菜,產(chǎn)量計算為兩季的總產(chǎn)量。其中,第1季為2010年冬季菠菜,第2季為2011春季菠菜。試驗表明,菠菜產(chǎn)量受所施用肥料的影響較大,施肥對菠菜產(chǎn)量提高效果明顯。由表3可知,不同處理間每盆菠菜的平均產(chǎn)量差異顯著。與CK處理相比,T4處理的產(chǎn)量增加最大,每盆平均產(chǎn)量達到277.73g,產(chǎn)量增加170%;T3、T2、T5和T1處理的增產(chǎn)量依次減少,平均每盆產(chǎn)量分別為267.53g、264.38g、241.62g和220.13g。其中,化肥減量施用的T2、T3、T4和T5處理產(chǎn)量均比常規(guī)化肥用量T1處理產(chǎn)量高,達到了化肥減量而不減產(chǎn)甚至增產(chǎn)的效果。由此可見,菌劑可以替代部分化肥,減少農(nóng)業(yè)化肥用量。

2.2菌劑處理對菠菜土壤微生物多樣性的影響

2.2.1土壤微生物DGGE指紋圖譜分析

對不同處理菠菜栽培土壤微生物16SrDNAV3可變區(qū)片斷進行DGGE指紋圖譜分析的結果(圖1a)表明,不同施肥處理下盆栽菠菜土壤的微生物基因區(qū)系條帶出現(xiàn)較小差別。與CK相比,各處理除T1外,條帶亮度略有增加,條帶數(shù)量無明顯差別。從圖1b16SrDNAV3區(qū)PCR擴增片段DGGE泳道圖譜可以看出,多數(shù)的明顯條帶在遷移率上基本一致,說明不同處理間具有大量的共有微生物種群,這主要是存在于試驗土壤中的土著微生物。微生物菌劑處理的明亮條帶明顯在圖譜中部多出現(xiàn)1~2個條帶,表明混合微生物菌劑與化肥的配施,提高了土壤主要微生物種群基因多樣性和數(shù)量。由于試驗在低溫的冬春季進行,土壤微生物本身活性也較低,生長繁殖速率較慢,因而不同施肥制度對微生物種群與數(shù)量的影響反映不夠明顯。

2.2.2土壤微生物DGGE條帶圖譜的聚類分析

不同施肥處理間的土壤微生物種群相似性表現(xiàn)為DGGE條帶聚類分析的相似性系數(shù),相似性系數(shù)越高,種群多樣性越趨于一致,如圖2所示。本試驗中,T4和T5處理間的土壤微生物種群相似性最高,達到0.80,被聚為一類,與T1處理的相似性系數(shù)為0.76,同時與CK都聚在一個大類;而T2和T3處理又被單獨聚在一類,相似性系數(shù)為0.70;兩個大類間最低相似性系數(shù)也達到0.65。一般認為相似值高于0.60的兩個群體具有較好的相似性,將6個樣品歸為一類的相似值達0.65,說明種植1茬菠菜后,不同施肥制度的土壤細菌群落結構相似性程度提高。

2.2.3土壤微生物種群DNA多樣性分析

對不同處理土壤的微生物16SrDNA的DGGE條帶進行香農(nóng)威爾多樣性指數(shù)(Shannon-Wiernerindex)分析,結果見表4。從表4可以看出,豐富度指數(shù)以T1處理最低,T3處理最高,與不施肥處理CK相比,常規(guī)化肥處理T1的土壤細菌豐富度指數(shù)有所降低,而添加微生物菌劑的則有所提高;而Shannon-Wierner指數(shù)在各處理間差異較為明顯,與不施肥處理CK相比,常規(guī)化肥處理T1的土壤細菌多樣性有所降低,而添加微生物菌劑的各處理卻有明顯提高。該結果表明,常規(guī)化肥處理不利于提高土壤微生物種群多樣性;相反,在化肥減量情況下,配施有益的微生物菌劑,有利于改善土壤中主要微生物種群結構,提高微生物種群多樣性。

3討論與結論

本研究中,施用微生物菌劑顯著提高了菠菜葉綠素含量,以T5和T4處理最好;顯著提高了菠菜對NPK養(yǎng)分的吸收與轉(zhuǎn)化,以T5和T2處理最好;而對葉綠素熒光參數(shù)作用不明顯;菠菜硝酸鹽含量為常規(guī)化肥處理>化肥減量20%處理>化肥減量40%處理>不施肥CK處理。微生物菌劑部分替代化肥引起菠菜硝酸鹽含量減少,從而提高了菠菜品質(zhì)。土壤中有效氮、磷、鉀養(yǎng)分的持續(xù)供給是影響菠菜營養(yǎng)生長階段重要的因素[3],本試驗中,微生物菌劑具有這方面功能。當環(huán)境中有效養(yǎng)分充足,菠菜生長期延長,長得更高更壯,最大限度地增加生物量,提高產(chǎn)量。本研究中菠菜產(chǎn)量以添加微生物菌劑并減少化肥用量40%的處理最好,各處理間差異顯著。與CK相比,T4處理增產(chǎn)幅度最高,達到170%,與T1相比,也增產(chǎn)26.2%,這與前人的研究結論一致。崔美華等[910]研究表明,微生物菌劑對東北水稻的增產(chǎn)率達13.5%。這是因為微生物菌劑的有益菌群在土壤中定殖后,分泌有機酸可以溶解釋放出被土壤顆粒等吸附的NPK養(yǎng)分,從而延長了土壤NPK養(yǎng)分的有效供給,促進了菠菜營養(yǎng)生長?？梢?微生物菌劑應用的增產(chǎn)效果明顯。

許多研究報道指出,土壤微生物群體變化與施肥類型和施肥用量有關[1113]。施無機肥對土壤微生物多樣性及活性的影響,目前的尚有爭議[1415]。并且,由于目前技術的制約,PCR-DGGE技術體系只能研究土壤中微生物量較大的種群,不能完全反映土壤中所有微生物種群數(shù)量。Sarathandra等[16]研究新西蘭漢密爾頓的兩個砂壤土試驗區(qū)施肥對土壤微生物的影響,結果顯示無機肥對土壤微生物群落有一定的影響。本試驗中以T3處理土壤微生物多樣性最好,豐富度指數(shù)為13、Shannon-Wierner指數(shù)為0.983,常規(guī)化肥處理(T1)最差,與Sarathandra等[16]的研究一致。表明微生物菌劑能夠保持和提高土壤微生物豐富度指數(shù)和香農(nóng)威爾(Shannon-Wierner)多樣性指數(shù),穩(wěn)定農(nóng)田土壤環(huán)境中微生物種群多樣性;常規(guī)化肥處理導致土壤微生物種群多樣性的降低。值得注意的是,本研究各處理的生物種群豐富度均不高,與Duan等[17]研究結果有一定差異。此外,土壤溫度、有機質(zhì)含量也是影響微生物種群數(shù)量的重要因素,溫度太低、有機質(zhì)過少都不利于微生物增殖與外來種的定植[18]。由于農(nóng)田土壤環(huán)境中微生物種群多樣性受試驗田長期試驗、土壤有機質(zhì)較少、試驗環(huán)境溫度低的影響,各試驗結果的總體物種豐富度不高。鑒于此,以后可選擇固定試驗田或土壤中進行長期試驗,進一步研究長期穩(wěn)定施肥處理條件下微生物菌劑對土壤微生物多樣性的影響。