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【關(guān)鍵詞】酒精性肝病

1乙醇體外誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡

與TGFβ和抗Fas單克隆抗體對(duì)肝細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用相似［1］,低濃度的乙醇能夠在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞發(fā)生凋亡［2］。由于腫瘤細(xì)胞的易培養(yǎng)性,往往以肝癌細(xì)胞代替肝細(xì)胞建立乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。乙醇能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞凋亡,并且其誘導(dǎo)凋亡的效果強(qiáng)于絲裂霉素C［3］。用不同濃度的乙醇作用于HepG2細(xì)胞和人正常肝細(xì)胞系HPH細(xì)胞不同時(shí)間之后,每例取6×103個(gè)細(xì)胞進(jìn)行透射電鏡分析。發(fā)現(xiàn)乙醇對(duì)肝細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用強(qiáng)于對(duì)肝癌細(xì)胞的作用（P<0.05）,而且肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞凋亡的發(fā)生程度與乙醇的濃度和作用時(shí)間顯著正相關(guān)（P<0.01）［4］。

2酒精性肝病中的肝細(xì)胞凋亡

Kawahara等［5］用免疫組化法檢測(cè)了凋亡相關(guān)抗原Lewis在20例ALD患者（平均每天攝入酒精80g以上）的肝活檢組織的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)含Mallory小體的肝細(xì)胞呈Lewis抗原陽(yáng)性表達(dá),提示至少部分含Mallory小體的肝細(xì)胞以凋亡的方式被清除。TUNEL法檢測(cè)結(jié)果表明,ALD組織的凋亡發(fā)生率明顯高于正常肝組織,并且在氣球樣變性、膽汁淤積、炎癥區(qū)和結(jié)節(jié)性肝硬化部位更為明顯［6］。Goldin等［7］用連續(xù)23天乙醇蒸汽吸入法建立了小鼠ALD模型。在21只正常對(duì)照小鼠中,只有36%的肝末端小靜脈可見(jiàn)凋亡小體,并且這些凋亡小體中的88%位于中央靜脈周?chē)鷥膳诺母渭?xì)胞。實(shí)驗(yàn)組41只小鼠中,72%的肝末端小靜脈可見(jiàn)凋亡小體,并且這些凋亡小體大多數(shù)不只是位于中央靜脈周?chē)鷥膳诺母渭?xì)胞,肝細(xì)胞凋亡程度與肝細(xì)胞損傷程度密切相關(guān)。在停止吸入酒精蒸氣后,肝細(xì)胞凋亡現(xiàn)象逐漸減輕,并且經(jīng)過(guò)一段時(shí)間之后肝組織結(jié)構(gòu)可完全恢復(fù)正常。說(shuō)明ALD中凋亡小體產(chǎn)生的數(shù)量和位置具有時(shí)間依賴(lài)性,肝組織損傷具有可復(fù)性。Baioni等［8］在用定量分析法證實(shí)了大鼠慢性酒精中毒肝細(xì)胞凋亡率上升的趨勢(shì)之后,用以BrdU檢測(cè)分裂期細(xì)胞的方法表明,其肝細(xì)胞增殖率也明顯上升。在大鼠ALD的逐步發(fā)展過(guò)程中,不僅凋亡的肝細(xì)胞不斷增多,而且肝細(xì)胞的增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）陽(yáng)性率也不斷增高［9］。在小型豬ALD模型中也可見(jiàn)到不僅肝細(xì)胞凋亡小體隨著ALD的發(fā)展而明顯增多,肝細(xì)胞的PCNA陽(yáng)性表達(dá)率也逐漸增高［10］。提示在ALD中肝細(xì)胞凋亡現(xiàn)象及其再生修復(fù)同時(shí)存在。

3酒精性肝病中肝細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制

關(guān)于ALD中肝細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明,目前認(rèn)為其主要與以下幾種因素有關(guān):（1）肝細(xì)胞色素p4502E1（CYP2E1）的活化。在正常肝臟中,CYP2E1主要分布在中央靜脈周?chē)母渭?xì)胞,此處正是ALD病理?yè)p傷的好發(fā)部位。在ALD組織中,CYP2E1活性普遍較高。CYP2E1具有很強(qiáng)的MADPH氧化酶活性,可使乙醇氧化生成羥乙基根,使肝細(xì)胞反應(yīng)性氧中間產(chǎn)物和脂質(zhì)過(guò)氧化終產(chǎn)物增多,產(chǎn)生對(duì)肝細(xì)胞的毒性作用,引起肝細(xì)胞凋亡。經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)把CYP2E1基因轉(zhuǎn)染到HepG2細(xì)胞中,并使其穩(wěn)定表達(dá)。在乙醇誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)染CYP2E1基因的細(xì)胞較未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞更容易發(fā)生凋亡CYP2E1拮抗劑，抗氧化劑都能夠?qū)挂掖紝?duì)肝細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用［11］。從大豆中提取的一種多聚不飽和卵磷脂能夠降低乙醇特異性CYP2E1的產(chǎn)生和對(duì)抗氧化,從而減輕乙醇引起的肝細(xì)胞凋亡,說(shuō)明CYP2E1確實(shí)在乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡中具有重要的作用［12］。（2）肝臟鐵負(fù)荷增加。鐵可催化自由基的生成,并增強(qiáng)肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)。在大鼠飲食中加入碳酸鐵,可加重其ALD所致的肝損傷,使肝細(xì)胞凋亡程度增加［13］。（3）腫瘤壞死因子（TNF）和TNF受體的活性增高。用乙醇誘導(dǎo)凋亡的HepG2細(xì)胞與凋亡前相比,TNF-α表達(dá)水平增高了35倍,IL-1α和IL-6的水平也分別有所增高［14］。乙醇能夠阻止TNF-α激活肝細(xì)胞內(nèi)對(duì)氧化還原作用敏感的轉(zhuǎn)錄因子NFkB,使肝細(xì)胞增殖活性下降,肝細(xì)胞對(duì)BclxL等生存基因的表達(dá)減弱,破壞TNF-α和其他與肝細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)有關(guān)的細(xì)胞因子對(duì)肝臟的營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)作用［15］。（4）促氧化物增多和抗氧化物減少造成的氧應(yīng)激反應(yīng)。乙醇代謝過(guò)程中產(chǎn)生的氧化劑能夠誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生凋亡,并使DNA產(chǎn)生片段化。谷胱甘肽等細(xì)胞內(nèi)的抗氧化劑能夠?qū)挂掖家鸬母渭?xì)胞凋亡［16］。用共聚焦顯微鏡研究的結(jié)果顯示,能夠?qū)挂掖家鸬难趸瘔毫Φ脑噭┛捎行У販p輕乙醇引起的肝細(xì)胞凋亡或壞死。并且,細(xì)胞內(nèi)抗氧化劑的抑制劑能夠加重乙醇誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡［17］。（5）肌纖維母細(xì)胞和TGF-β的誘導(dǎo)凋亡作用在ALD中,來(lái)自肝星狀細(xì)胞的肌纖維母細(xì)胞不僅能夠合成和分泌一些膠原和非膠原基質(zhì)蛋白,而且可使成纖維生長(zhǎng)因子TGF-β的分泌增加。TGF-β是一種公認(rèn)的肝細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑。Gressner等［18］分離了大鼠的肌纖維母細(xì)胞,并在體外觀察此肌纖維母細(xì)胞對(duì)肝細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。發(fā)現(xiàn)當(dāng)肌纖維母細(xì)胞分泌TGF-β時(shí),用DNA熒光染料Hoechst33342染色可見(jiàn)肝細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)變化,TUNEL法檢測(cè)顯示有很多明顯的陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn),并可用瓊脂糖凝膠電泳觀察到凋亡細(xì)胞特有的梯狀DN段化。當(dāng)肌纖維母細(xì)胞不分泌TGF-β時(shí),肝細(xì)胞未見(jiàn)明顯的凋亡發(fā)生。提示肝臟的肌纖維母細(xì)胞可能通過(guò)增加TGF-β的分泌來(lái)誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡。（6）某些凋亡相關(guān)分子的變化。ALD肝組織的CD95受體及其配體表達(dá)水平普遍增高,細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTLs）能夠通過(guò)CD95受體和配體的相互作用啟動(dòng)細(xì)胞凋亡［13］。Deaciuc等［19］用給大鼠連續(xù)7天喂食含乙醇液體飲食的方法建立了ALD模型。分離ALD大鼠的肝細(xì)胞、枯否細(xì)胞和肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞之后分別檢測(cè)其Caspase3表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)均較正常對(duì)照組明顯增高。乙醇誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞凋亡過(guò)程中Caspase1和Caspase3表達(dá)水平明顯增高,并可分別被ICE蛋白抑制劑和bcl2基因轉(zhuǎn)染所抑制［11］。提示上述凋亡相關(guān)分子的變化可能在ALD肝細(xì)胞凋亡發(fā)生過(guò)程中具有一定的作用。

4內(nèi)毒素、炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子

炎癥介質(zhì)和（或）細(xì)胞因子對(duì)酒精性肝病的形成具有重要的作用［20］。酒精的攝入可致炎癥細(xì)胞對(duì)炎癥刺激過(guò)度的反應(yīng)產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì)和（或）細(xì)胞因子,即所謂的激發(fā)和致敏。一方面,肝細(xì)胞損傷后,可發(fā)生肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的凋亡和壞死,激活肝內(nèi)的Kupffer細(xì)胞和血循環(huán)中的單核細(xì)胞。另一方面,酒精性肝病時(shí),因腸細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)、腸黏膜通透性增加、腸細(xì)菌移位以及正常的免疫功能受抑制等,導(dǎo)致腸源性?xún)?nèi)毒素血癥［21］。內(nèi)毒素不僅可直接損傷肝細(xì)胞,更重要的是內(nèi)毒素還與Kupffer細(xì)胞特異受體CD14及TLR4（Tolllikereceptor4）結(jié)合激活該細(xì)胞。進(jìn)而可釋放大量的氧自由基、細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì),如TNF-β、IL-6、IL-10、IL-12、IFN-β、TGF-β、PDGF等。不僅如此，細(xì)胞黏附分子和細(xì)胞因子受體表達(dá)也增加。多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)可引起肝細(xì)胞進(jìn)一步壞死、凋亡、炎癥和肝纖維化形成。尤其是腸源性?xún)?nèi)毒素血癥在ALD的形成過(guò)程中的作用至關(guān)重要,內(nèi)毒素可使Kupffer細(xì)胞釋放TNF-β和NO,誘發(fā)肝細(xì)胞壞死與凋亡,并發(fā)現(xiàn)TNF-α與各種細(xì)胞膜上的受體結(jié)合可增加細(xì)胞內(nèi)活性氧形成,誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。不僅如此,對(duì)酒精性肝病時(shí)Kupffer細(xì)胞TNF-β表達(dá)上調(diào)的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),慢性酒精的攝入能增加內(nèi)毒素刺激的細(xì)胞外受體活性激酶1/2（ERK1/2）的活性,促進(jìn)早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子1（Egr1）的表達(dá),并使Egr1與TNF-β啟動(dòng)子結(jié)合力增加。臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均表明ALD血循環(huán)中TNF-α明顯升高,運(yùn)用TNF-α中和抗體能減輕酒精所致大鼠的肝損傷。通過(guò)飲食含乳酸桿菌食物或用多粘菌素B或新霉素等抗生素,改善腸黏膜的屏障功能、抑制腸道細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)以減少內(nèi)毒素的生成等措施,均能明顯減輕實(shí)驗(yàn)性酒精性肝病的嚴(yán)重程度。應(yīng)用氯化釓（GdCI3）選擇性破壞枯否細(xì)胞,可在很大程度上阻斷酒精性肝病的發(fā)生,阻斷內(nèi)毒素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),均能減輕酒精性肝損傷［22,23］。

5總結(jié)

綜上所述,乙醇不僅能夠在體外誘導(dǎo)肝細(xì)胞或肝癌細(xì)胞凋亡,而且動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證實(shí),ALD中肝細(xì)胞凋亡率明顯增高,肝細(xì)胞凋亡與ALD病變的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)。目前,在乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡與ALD關(guān)系的研究中有待于解決的問(wèn)題主要是:（1）ALD動(dòng)物模型的建立。盡管已經(jīng)用含乙醇液體飼料喂養(yǎng)、酒精灌胃和乙醇蒸氣吸入等方法建立了許多大鼠、小鼠和狒狒等動(dòng)物的ALD模型,但是其與人類(lèi)ALD的病理變化仍有一定程度的差異。其中,以用狒狒建立的模型最接近于人類(lèi)ALD,但是狒狒模型還存在價(jià)格昂貴,不易操作和結(jié)果不易重復(fù)的缺點(diǎn)。目前尚缺乏既能比較完全地模仿人類(lèi)ALD的病理變化,又簡(jiǎn)便易行的動(dòng)物模型;（2）ALD中肝細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制尚不明確。盡管已經(jīng)明確了ALD中肝細(xì)胞凋亡的發(fā)生與CYP2E1的活化,鐵負(fù)荷增加,TNF和TNF受體活性增高,促氧化物增多和抗氧化物減少造成的氧應(yīng)激反應(yīng),肌纖維母細(xì)胞和TGF-β的誘導(dǎo)凋亡作用以及某些凋亡相關(guān)分子的變化密切相關(guān),但是其具體的作用機(jī)制和信號(hào)傳導(dǎo)通路尚不清楚;（3）ALD中肝細(xì)胞凋亡與抗凋亡的平衡機(jī)理。在ALD中,肝細(xì)胞不僅發(fā)生凋亡,其增殖功能也變得異?；钴S,PCNA指數(shù)和BrdU數(shù)值都明顯增高,說(shuō)明伴隨著乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的發(fā)生,肝細(xì)胞發(fā)生了再生。在ALD中,肝細(xì)胞凋亡率明顯增高的同時(shí),肝臟膽管上皮細(xì)胞和炎癥細(xì)胞的bcl2蛋白表達(dá)水平也明顯上升［9］。說(shuō)明ALD中還存在著肝細(xì)胞凋亡和肝臟抗凋亡的動(dòng)態(tài)平衡問(wèn)題。目前對(duì)這一問(wèn)題尚缺乏比較深入的認(rèn)識(shí)。

隨著新的凋亡相關(guān)分子的逐漸發(fā)現(xiàn),以及對(duì)ALD發(fā)病機(jī)制的深入研究,乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡與ALD的關(guān)系會(huì)得到進(jìn)一步明確,ALD中肝細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制也必然會(huì)得到進(jìn)一步揭示。

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