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凝膠色譜法范文第1篇

[關(guān)鍵詞]凝膠色譜法 測(cè)定 頭孢美唑鈉 聚合物

中圖分類號(hào)：TH23 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1009-914X（2015）10-0332-01

頭孢美唑鈉是一種半合成抗生素，其屬于第三代頭孢菌素，在臨床治療中有著廣泛的應(yīng)用，在臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，這一藥物的抗菌性比較強(qiáng)，而且有著良好的藥效。通過測(cè)定實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，為了提高頭孢美唑鈉的藥效，必須控制好其生產(chǎn)的質(zhì)量，控制高分子雜質(zhì)的產(chǎn)生，這樣可以防止患者的服用這一藥物時(shí)出現(xiàn)過敏反應(yīng)，還可以降低藥物的毒性，防止藥品醫(yī)療事故的發(fā)生。本文通過建立凝膠色譜法測(cè)定頭孢美唑鈉中聚合物的方法，提高了藥品質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果的可靠性，對(duì)藥品生產(chǎn)安全也有著保障作用。

一、儀器與試藥

1、儀器

KGF-02型高分子聚合物測(cè)定儀（上海金達(dá)生化儀器廠）；WHSOO}JSB伍豪色譜土作站（上海伍豪信息科技有限公司）；色譜柱（40一120 μm葡聚糖凝膠G 10為填料）；玻璃柱（內(nèi)徑1.3一1. 6 cm，柱高30一40 cm） ； BP211 D型分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]。

2、藥品與試劑

頭孢美唑鈉對(duì)照品（批號(hào)：MZW S0901，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：91.7%）；注射用頭孢美唑鈉（批號(hào)：090101，090102，090103深圳立健藥業(yè)股份有限公司）；Naz HPOQ ， NaHz PO、均為分析純；純化水為公司自制；葡聚糖凝膠（Sephadex） G-0、藍(lán)色葡聚糖2000（Amersham Bioscience公司）。

二、方法與結(jié)果

1、溶液的制備

1.1對(duì)照溶液的制備

實(shí)驗(yàn)人員首先需要稱取適量頭孢美唑鈉原料，然后加入純化水進(jìn)行溶解，將其制備為1mL溶液含0.2mg頭孢美唑的對(duì)照溶液。這一過程主要是定量稀釋，對(duì)精確度有著較高的要求。

1.2供試品溶液的制備

采用精密的儀器，稱取0.2g注射用頭孢美唑鈉，然后將其置于10mL的容量瓶中，再加入一定量的純化水進(jìn)行稀釋，達(dá)到規(guī)定的刻度后做搖勻處理。這一過程要求研究人員必須規(guī)范操作。

2、色譜條件

色譜柱為葡聚糖凝膠G-10柱（40一120μm，柱內(nèi)徑1.3一1. 6 cm，柱高30一40 cm）；流動(dòng)相A為pH7. 0的0. 02 mol/L磷酸鹽緩沖液[0. 02 mol/LNaz HPOQ -0. 02 mol / L NaH2 PO4（體積比61： 39 ） ]，流動(dòng)相B為純化水；流速為1.5 mL/min；檢測(cè)波長為254 nm；進(jìn)樣量為200μL。

3、系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密稱取藍(lán)色葡聚糖2000適量，加純化水定量稀釋成質(zhì)量濃度為0. 1 mg/mL的溶液，精密量取200 μL，注入液相色譜儀，分別以流動(dòng)相A，B進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。按藍(lán)色葡聚糖2000峰計(jì)算理論塔板數(shù)應(yīng)不低于700，拖尾因子應(yīng)小于2. 0。在2種流動(dòng)相系統(tǒng)中藍(lán)色葡聚糖2000的保留時(shí)間的比值應(yīng)在0. 93一1. 07之間，對(duì)照溶液主峰、供試品溶液中聚合物峰與相應(yīng)色譜系統(tǒng)中藍(lán)色葡聚糖2000峰的保留時(shí)間的比值均應(yīng)在0. 93一1. 07之間。稱取注射用頭孢美唑鈉約0. 2 g，置10 mL容量瓶中，用1 mg/mL的藍(lán)色葡聚糖2000溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取200μL注入液相色譜儀，用流動(dòng)相A進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。聚合物峰高與單體間，及聚合物之間的谷高比（分離度R）應(yīng)大于2.0。另以流動(dòng)相B為流動(dòng)相，精密量取對(duì)照溶液200μL，連續(xù)測(cè)定5次，峰面積RSD值應(yīng)不大于5. 0% 。見圖1、表1（其中A表示藍(lán)色葡聚糖2000在流動(dòng)相A中，B表示藍(lán)色葡聚糖2000在流動(dòng)相B中，C表示對(duì)照溶液在流動(dòng)相B中，D表示供試品溶液在流動(dòng)相A中）。

4、注射用頭孢美唑鈉中聚合物的測(cè)定

取注射用頭孢美唑鈉約0. 2 g，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，加純化水溶解并稀釋至刻度，搖勻。立即精密量取200 μL注入液相色譜儀，以流動(dòng)相A為流動(dòng)相進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。另精密量取對(duì)照溶液200 μL注入液相色譜儀，以流動(dòng)相B為流動(dòng)相進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。

5、定量限的測(cè)定

分別取頭孢美唑鈉對(duì)照品適量，精密稱定，加水稀釋制成系列質(zhì)量濃度的對(duì)照溶液。分別精密量取上述溶液200 μL注入液相色譜儀，以流動(dòng)相B為流動(dòng)相依法進(jìn)行測(cè)定，以信噪比10： 1為指標(biāo)，測(cè)得定量限為0.034μg/mL。

6、穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批注射用頭孢美唑鈉（批號(hào)：090101）約0. 2 g，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。分別于0，1，2，4 h精密吸取200 μL注入液相色譜儀，以流動(dòng)相A為流動(dòng)相進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果聚合物峰面積的RSD值為15. 62%，表明供試品溶液中聚合物的峰面積隨放置時(shí)一間的延長而增大，因此應(yīng)在供試品溶液配制后立即進(jìn)樣測(cè)定。

三、討論

在不同的酸堿條件下，頭孢菌素發(fā)生聚合反應(yīng)的難易程度不同，一般在強(qiáng)堿與強(qiáng)酸條件下，注射用頭孢美唑鈉較易發(fā)生聚合反應(yīng)，會(huì)生成一定量聚合物，本文采用凝膠色譜法對(duì)這一聚合物進(jìn)行了測(cè)定，通過分析注射用頭孢美唑鈉的高分子聚合物含量，可以為頭孢美唑鈉的質(zhì)量檢驗(yàn)提供依據(jù)。由于頭孢菌素在堿性以及酸性條件下會(huì)發(fā)生聚合反應(yīng)，所以，在測(cè)定的過程中，選用了pH值為7的磷酸鹽緩沖液作為流動(dòng)相。

分子排阻色譜法是一種有效的藥物檢測(cè)方法，其對(duì)頭孢高分子雜質(zhì)有著較好的檢測(cè)效果。在本次實(shí)驗(yàn)中，由于頭孢美唑鈉高分子聚合物對(duì)照品不宜獲取，而且實(shí)驗(yàn)樣品中高聚物的數(shù)量也比較少，為了提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，需要在配制檢測(cè)分離度時(shí)，加入一定量的葡萄糖，這可以增加聚合物峰值面積，加入量的具體數(shù)值可依實(shí)際情況穩(wěn)定，要保證聚合物峰面積達(dá)到規(guī)定值的2倍左右。通過實(shí)驗(yàn)證明，頭孢美唑鈉聚合物的分離度、拖尾因子以及保留時(shí)間符合藥品適用性的要求。本次實(shí)驗(yàn)采用了封閉式凝膠柱，流相的流速達(dá)到了1.5mL/min，在洗脫處理后，聚合物既滿足分離的質(zhì)量要求，也提高了分離的效率，縮短了分析時(shí)間。

注射用頭孢美唑鈉聚合物的形成具有動(dòng)態(tài)性，聚合物樣品中高分子雜質(zhì)的數(shù)量與溶液放置的時(shí)間有著較大關(guān)系，一般放置的時(shí)間越長，聚合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)越大，所以，為了保證測(cè)定的準(zhǔn)確性，研究人員需要掌握好時(shí)間，這樣才能提高測(cè)定結(jié)果的可靠性。當(dāng)供試品溶液配制中得到聚合物后，一定要及時(shí)測(cè)定。另外，在測(cè)定的過程中，測(cè)定方法的選用需要參考《中國藥典》的 相關(guān)檢測(cè)要求，一定要考慮高分子雜質(zhì)的影響。本次試驗(yàn)與研究表明：凝膠色譜法測(cè)定注射用頭孢美唑鈉聚合物，具有操作簡單、靈敏度高、可控性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可以有效提高頭孢美唑鈉聚合物的質(zhì)量控制水平。

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凝膠色譜法范文第2篇

植物油是人類生活的必需消費(fèi)品，其質(zhì)量安全直接關(guān)系到消費(fèi)者的身體健康。我國規(guī)定了棉籽油、花生油、大豆油及菜籽油中擬除蟲菊酯類和有機(jī)磷類農(nóng)藥的殘留限量（005～05 mg/kg）＼[1＼]。目前，對(duì)于植物油的農(nóng)藥多殘留檢測(cè)前處理方法主要是采用液液萃?。↙LE）＼[2＼]，結(jié)合固相萃?。⊿PE）＼[3，4＼]，凝膠色譜（GPC）＼[5＼]或基質(zhì)固相分散（MSPD）＼[6＼]進(jìn)行。隨著前處理技術(shù)的發(fā)展，新的前處理技術(shù)被應(yīng)用到植物油中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)中，如在線GPC系統(tǒng)＼[7，8＼]及QuEChERS法＼[9～12＼]。這類方法的出現(xiàn)，使得樣品前處理變得簡單，有時(shí)甚至不需進(jìn)行前處理。但也存在如基質(zhì)干擾較嚴(yán)重＼[7，8＼]、檢出限偏高＼[7＼]、處理時(shí)間長＼[9～12＼]等問題。

本研究將QuEChERS方法結(jié)合在線GPCGCMS系統(tǒng)用于檢測(cè)植物油中的多農(nóng)藥殘留，將毒鼠強(qiáng)以及多種中高毒農(nóng)藥納入到研究范圍，與已報(bào)道的方法＼[9～13＼]相比，采用QuEChERS法處理樣品時(shí)不需調(diào)節(jié)pH值，無需進(jìn)行冷凍除脂，且所需樣品量少，進(jìn)一步減小溶劑消耗； 在線GPCGCMS系統(tǒng)中的GPC部分可以很好地彌補(bǔ)QuEChERS法去除干擾物質(zhì)不徹底的問題，利用大體積進(jìn)樣（LVI）技術(shù)，可將GCMS的靈敏度進(jìn)一步提高，而且能夠抑制部分基質(zhì)效應(yīng)。本方法具有較高的靈敏度及精密度，較低的分析成本，可用于葵花油、大豆油和玉米油中34種農(nóng)藥殘留快速篩查與檢測(cè)。

23實(shí)驗(yàn)方法

對(duì)濃度為100 mg/L的13種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品（甲拌磷、地蟲硫磷、治螟磷、苯線磷、甲基對(duì)硫磷、對(duì)硫磷、特丁硫磷、乙基嘧啶磷、蠅毒磷、狄氏劑、異狄氏劑、克百威、氟蟲腈等）各2支，毒鼠強(qiáng)取用1支，全部轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶。對(duì)20種農(nóng)藥固體標(biāo)準(zhǔn)品（久效磷、殺螟硫磷、甲胺磷、氯唑磷、丁基嘧啶磷、亞胺硫磷、乙硫磷、殺撲磷、甲基立枯磷、伏殺磷、丙溴磷、乙拌磷、丙線磷、三氯殺螨醇、林丹、氰戊菊酯、p，p滴滴滴、p，p滴滴伊、o，p滴滴涕、p，p滴滴涕）每種稱取10 mg，加入到10 mL容量瓶中，先用少量丙酮溶解，然后用正己烷定容， 配制成質(zhì)量濃度均為1000 mg/L的儲(chǔ)備液，吸取200 μL儲(chǔ)備液轉(zhuǎn)移到同一50 mL容量瓶中本研究采用氟胺氰菊酯和滅螨猛校準(zhǔn)混合物（10 mg/L）進(jìn)行時(shí)間定位（大多數(shù)農(nóng)藥分子量介于氟胺氰菊酯和滅螨猛之間），在22節(jié)GPC條件下，氟胺氰菊酯和滅螨猛保留時(shí)間相差小于2 min（圖1）。本研究收集340～540 min餾分到200 μL定量環(huán)中，使得34種農(nóng)藥完全進(jìn)入GCMS系統(tǒng)中進(jìn)行分析檢測(cè)。其它餾分由GPC排到系統(tǒng)外，由此可使樣品中的雜質(zhì)進(jìn)一步去除，進(jìn)而減小基質(zhì)效應(yīng)、降低分析背景、改善色譜峰形，且GPC系統(tǒng)克服了常規(guī) GPC消耗溶劑量大、自動(dòng)化差、操作繁瑣等問題。

GPC系統(tǒng)與GCMS系統(tǒng)采用程序升溫大體積進(jìn)樣口連接（PTVLVI），利用大體積進(jìn)樣技術(shù)，可將GCMS的靈敏度進(jìn)一步提高， PTVLVI技術(shù)可以快速的加熱或者冷卻，減少熱不穩(wěn)定農(nóng)藥的分解，且較高的載氣流速可以減少目標(biāo)分析物在襯管中的停留時(shí)間，在一定程度上抑制基質(zhì)效應(yīng)。

32萃取劑及萃取方式的選擇

按24節(jié)處理步驟，在3支10 mL玻璃試管中各加入040 g葵花油樣品，并按01 μg/g加入標(biāo)準(zhǔn)溶液。比較了乙腈丙酮（1∶1， V/V）、正己烷飽和的乙腈及乙腈3種萃取劑的萃取效率。樣品經(jīng)不同萃取劑萃取后的凈化效果見圖2。結(jié)果表明，采用乙腈丙酮（1∶1， V/V）萃取時(shí)基質(zhì)干擾嚴(yán)重，不適合作為此方法的萃取劑；

34基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是農(nóng)藥分析需要考慮的問題＼[18＼]。本研究在采用純?nèi)軇┡渲频臉?biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量時(shí)，除甲胺磷、治螟磷、林丹、氯唑磷、丁基嘧啶磷、甲基立枯磷、乙基嘧啶磷，其余24種農(nóng)藥（除p，p′DDE， p，p′DDD， p，p′DDT）均有不同程度的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。采用歐盟DG SANCO＼[15＼]中的規(guī)定，利用不含農(nóng)藥的空白基質(zhì)匹配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，使之達(dá)到與樣品中農(nóng)藥同等的響應(yīng)。

4結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用QuEChERS方法對(duì)葵花油樣品前處理方法進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)合GPCGCMS建立了一套可同時(shí)測(cè)定葵花油、大豆油和玉米油中31種 （不包括p，p′DDE， p，p′DDD， p，p′DDT） 中高毒農(nóng)藥的快速篩查方法，檢出限、定量限、回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均能滿足農(nóng)藥多殘留檢測(cè)方法的要求， p，p′DDE， p，p′DDD， p，p′DDT滿足定性要求。采用QuEChERS法結(jié)合GPCGCMS在線聯(lián)用，一方面GPC系統(tǒng)彌補(bǔ)了QuEChERS前處理方法去干擾物質(zhì)不徹底的問題，提高了方法的靈敏度、分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，且在線GPC系統(tǒng)從進(jìn)樣到完成色譜柱沖洗僅需要使用10 mL有機(jī)溶劑，符合綠色化學(xué)的理念； 另一方面，采用QuEChERS法進(jìn)行樣品前處理，食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量 中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn) GB/T 27632012

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凝膠色譜法范文第3篇

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法 發(fā)展 優(yōu)勢(shì) 劣勢(shì) 發(fā)展 應(yīng)用

高效液相色譜法使用的流動(dòng)相是液體，應(yīng)用高壓輸液裝置，將具有不同極性的單一溶劑或者不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相壓進(jìn)裝有固定相的色譜柱中，各種成分在柱內(nèi)分離以后，然后進(jìn)入檢測(cè)器被檢驗(yàn)，最后對(duì)試樣進(jìn)行分析。

一、高效液相色譜法的發(fā)展

1.高效液相色譜法的歷史

色譜分析法的一個(gè)分支就是高效液相色譜法，在20世紀(jì)60年代末期，以氣相色譜法和經(jīng)典液相色譜發(fā)為基礎(chǔ)，形成的一種新的分離和分析技術(shù)。到了1960年，隨著氣相色譜法理論和實(shí)踐的不斷發(fā)展，同時(shí)光學(xué)、機(jī)械、電子等技術(shù)也在不斷發(fā)展，液相色譜法逐漸被相關(guān)學(xué)者使用。到了20世紀(jì)60年代末，高效液相色譜發(fā)就應(yīng)用高壓泵和化學(xué)鍵合固定相。

2.高效液相色譜法和其他色譜法的比較

2.1高效液相色譜法和經(jīng)典液相色譜的比較

經(jīng)典液相色譜法使用的是粗粒多孔固定相，將固定相裝在口徑大、較長的玻璃柱管內(nèi)，流動(dòng)相只能通過重力流過色譜柱，溶質(zhì)在固定相的傳質(zhì)和擴(kuò)散的速度都很慢，因?yàn)橹娜肟趬毫苄?，?dǎo)致柱子的效果很差，在很大程度上增加了分析時(shí)間。而高效液相色譜法使用的固定相是全多孔微粒，將固定相裝在口徑小、短的不銹鋼的柱子內(nèi)，流動(dòng)相通過高壓輸液泵進(jìn)入了柱壓很大的色譜柱中，在固定相中，溶質(zhì)的傳質(zhì)和擴(kuò)散速度都很快，所以在很多的時(shí)間內(nèi)，柱子的效率和分離能力都很好。

2.2和氣象色譜法的比較

高效液相色譜法和氣象色譜法相比有很多的類似之處。氣象色譜法的選擇性很高、分析效率也不低，同時(shí)還具有很高的靈敏度和分析速度，可是這種分析方法只能對(duì)那些蒸氣壓低和沸點(diǎn)低的樣品進(jìn)行分析，對(duì)于那些高沸點(diǎn)的有機(jī)物、具有不高穩(wěn)定性的化合物、高分子物質(zhì)和生物活性物質(zhì)來說，這種方法就行不通了。經(jīng)過分析，只有20%的有機(jī)化合物可以使用氣象色譜法進(jìn)行分析。可是對(duì)高效液相色譜法來說，就能分離和分析剩余的80%的有機(jī)化合物。

二、高效液相色譜法的綜合分析

1.高效液相色譜法的有適合劣勢(shì)

高效液相色譜法和其它分析方法相比具有很高的分辨率，為了達(dá)到最佳的分離效果可以選擇流動(dòng)相和固定相；同時(shí)它的分析速度很快，一般只需要幾分鐘或者即使分鐘；它還具有很高的重復(fù)性，使用的樣品還可以回收；它使用的色譜柱還可以重復(fù)使用，非常環(huán)保；具有較高的自動(dòng)化程度，在進(jìn)行分析時(shí)，分析的精確度也很高。所以高效液相色譜法被廣泛應(yīng)用，尤其是對(duì)大部分的有機(jī)化合物進(jìn)行分離和分析，在分離和分析高沸點(diǎn)、極性強(qiáng)、大分子、熱穩(wěn)定差的化合物時(shí)有很大的優(yōu)勢(shì)。

可是高效液相色譜法需要很高的壓力，一般要達(dá)到150～350×102 KPa。同時(shí)如果流動(dòng)相的配比在進(jìn)樣器、柱接頭、連接管和檢測(cè)池等發(fā)生任何變化，或者被分離的物質(zhì)發(fā)生擴(kuò)散或者滯留的現(xiàn)象都會(huì)加寬色譜峰，降低柱效率。

2.對(duì)高效液相色譜法的分類

由于分離機(jī)制不同，高效液相色譜法可分為以下幾類。（1）吸附色譜。這種方法的固定相是固體吸附劑，流動(dòng)相是不同極性溶劑，根據(jù)各個(gè)組分在吸附劑上的吸附能力不同對(duì)其進(jìn)行分離。（2）分配色譜。這種方法的固定相是液體。因?yàn)槊恳粋€(gè)組分在固定相中的溶解能力不同，對(duì)試樣中的組分進(jìn)行分離。（3）親和色譜。這種方法主要是對(duì)固定相的結(jié)合特性進(jìn)行利用，然后將分子分離。親和色譜在凝膠過濾色譜柱上連接和有待分離的物質(zhì)有一定結(jié)合能力的分子，同時(shí)這種結(jié)合是可逆的，在對(duì)流動(dòng)條件進(jìn)行改變時(shí)，也能對(duì)其進(jìn)行分離。（4）離子交換色譜。這種色譜的固定相是離子交換劑，將離子交換樹脂上可電離的離子和流動(dòng)相中的具有相同電荷的溶質(zhì)離子進(jìn)行可逆交換，因?yàn)檫@些離子和交換劑的親和能力不同，就會(huì)分離開來。（5）體積排阻色譜。這種色譜的固定相是具有化學(xué)惰性的多孔性凝膠，固定相對(duì)各組分的體積阻滯作用不同，這樣各組分就會(huì)發(fā)生分離。因?yàn)榱鲃?dòng)相的不同又可分為凝膠過濾色譜和凝膠滲透色譜。

三、高效液相色譜法的應(yīng)用

1.高效液相色譜法的應(yīng)用范圍

對(duì)于那些高沸點(diǎn)不易揮發(fā)、熱穩(wěn)定性差的、高分子的、具有不同極性餓有機(jī)化合物，生物活性物質(zhì)和各種天然的物質(zhì)，高效液相色譜法都能對(duì)其進(jìn)行分離和分析。這些物質(zhì)在食品、合成藥物、石油化工產(chǎn)品、生物化工產(chǎn)品等方面都有應(yīng)用，其中在這些方面應(yīng)用的無機(jī)物中占20%，在這些方面應(yīng)用的有機(jī)物中占80%，特別是那些永久性氣體、易揮發(fā)的、具有中等分子量的化合物都能進(jìn)行分析。

2.高效液相色譜法應(yīng)用的限制

首先高效液相色譜法使用的流動(dòng)相是多種溶劑，同時(shí)使用這種方法進(jìn)行分析需要的成本比氣象色譜法高，對(duì)環(huán)境也會(huì)產(chǎn)生污染。特別是在進(jìn)行不同濃度的操作時(shí)，還要對(duì)其進(jìn)行洗脫，操作起來比氣象色譜法復(fù)雜。同時(shí)，這種方法使用的檢測(cè)器不是通用的，和氣象色譜相比就處于劣勢(shì)了?？墒沁@幾年蒸發(fā)激光散射檢測(cè)器逐漸被應(yīng)用，很有可能成為高效液相色譜法分析時(shí)一種通用的檢測(cè)器。還有就是，高效液相色譜法是不可能取代氣象色譜法的，因?yàn)閷?duì)于組成復(fù)雜、具有多種沸程的石油產(chǎn)品來說，它需要柱效達(dá)到10萬塊塔板和毛細(xì)管氣相分析發(fā)分析。最后，這種方法也無法取代中、低壓柱色譜法。在柱壓從200千帕升到到1兆帕?xí)r，具有生化活性的生化樣品收到壓力容易分解、變性。

四、結(jié)束語

高效液相色譜法是在氣象色譜和液相色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展的，同時(shí)發(fā)展也很快，因?yàn)檫@種方法操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確、效率高，當(dāng)前，在各個(gè)方面的應(yīng)用也非常廣泛?？墒沁@種方法也有缺陷，所以要不斷的對(duì)其進(jìn)行完善，使其變得更加快捷精準(zhǔn)。

參考文獻(xiàn)

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[4] 王俊德；商振華；郁蘊(yùn)璐.高效液相色譜法 [M]. 1992年03月第1版

凝膠色譜法范文第4篇

血紅蛋白的提取和分離一般步驟為樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。

1　樣品處理

1.1　紅細(xì)胞的洗滌

洗滌紅細(xì)胞的目的是去除雜蛋白，采集的血樣要及時(shí)采用低速短時(shí)間離心分離紅細(xì)胞，然后用膠頭吸管吸出上層透明的黃色血漿，將下層暗紅色的紅細(xì)胞液體倒入燒杯，再加入五倍體積的生理鹽水，緩慢攪拌10min，低速短時(shí)間離心，如此重復(fù)洗滌3次，直至上清液中沒有黃色，表明紅細(xì)胞已洗滌干凈。

1.2　血紅蛋白的釋放

在蒸餾水和甲苯作用下，紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白，加入蒸餾水后紅細(xì)胞液體積與原血液體積要相同。加入甲苯的目的是溶解細(xì)胞膜，有利于血紅蛋白的釋放和分離。

2　粗分離

2.1　分離血紅蛋白溶液

將攪拌好的混合溶液離心后，試管中的溶液分為4層。第1層為無色透明的甲苯層，第2層為白色薄層固體，是脂溶性物質(zhì)的沉淀層，第3層是紅色透明液體，這是血紅蛋白的水溶液，第4層是其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物。將試管中的液體用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。

2.2　透析

取1mL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300mL的物質(zhì)的量濃度為20mmol／L的磷酸緩沖液中，透析12h。透析可以去除樣品中分子量較小的雜質(zhì)。

3　純化

利用凝膠色譜柱可對(duì)血紅蛋白進(jìn)行純化(圖1)。

4　純度鑒定

使用最多的是SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。

5　血紅蛋白的提取和分離操作問題分析

5.1　血紅蛋白的提取

紅細(xì)胞分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少，未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和時(shí)間過長，會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。

5.2　檢測(cè)凝膠色譜柱的裝填是否成功的方法

由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質(zhì)，觀察色帶移動(dòng)的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時(shí)要重新裝柱。

5.3　凝膠的裝填標(biāo)準(zhǔn)：緊密、均勻

如果凝膠裝填得不夠緊密、均勻，就會(huì)在色譜柱內(nèi)形成無數(shù)的空隙，使本該進(jìn)入凝膠內(nèi)部的樣品分子從這些空隙中通過，擾亂洗脫液的流動(dòng)次序，影響分離的效果。

5.4　沸水浴處理加入洗脫液的濕凝膠的目的

這樣操作不但節(jié)約時(shí)間，還能除去凝膠中可能帶有的微生物，排除凝膠內(nèi)的空氣。

5.5　G--75

“G”代表凝膠的交聯(lián)程度、膨脹程度及分離范圍，75表示凝膠得水值，即每克凝膠膨脹時(shí)吸水7.5g。

5.6　裝填完后，立即用洗脫液洗脫的目的

此操作的目的是使凝膠裝填緊密。

5.7　實(shí)驗(yàn)過程加入檸檬酸鈉

加入檸檬酸鈉的目的是防止血液凝固；低速、短時(shí)離心防止白細(xì)胞沉淀；緩慢攪拌防止紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。

5.8　檢測(cè)血紅蛋白的分離是否成功的方法

如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。

6　典型例題

【例1】在血紅蛋白的提取和分離實(shí)驗(yàn)中，下列操作正確的是( )

A　分離紅細(xì)胞時(shí)需去除上層透明的黃色血漿

B　紅細(xì)胞釋放出血紅蛋白時(shí)只需加入蒸餾水

C　分離血紅蛋白溶液是低速短時(shí)間離心

D　洗脫時(shí)，待紅色蛋白質(zhì)下移即開始收集流出液

思維啟導(dǎo)：紅細(xì)胞釋放出血紅蛋白除需加入蒸餾水，還需加入40％體積的甲苯；分離血紅蛋白溶液是高速長時(shí)間離心；洗脫時(shí)，待紅色蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每5 mL收集一管，連續(xù)收集。

參考答案：A。

【例2】下列有關(guān)提取和分離血紅蛋白的程序，敘述錯(cuò)誤的是( )

A　樣品的處理就是通過一系列操作收集到血紅蛋白溶液

B　通過透析可能去除樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)，此為樣品的粗提取

C　可通過凝膠色譜法將相對(duì)分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去，即樣品的純化

D　可通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定血紅蛋白的純度

思維啟導(dǎo)：首先通過洗滌紅細(xì)胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即樣品的處理；再經(jīng)過透析去除相對(duì)分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)，即樣品的粗分離；然后通過凝膠色譜法將相對(duì)分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去，即樣品的純化；最后經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定，由此可知B的敘述錯(cuò)誤。由玻璃紙制成的透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而將大分子保留在袋內(nèi)，透析可以去除樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)。

參考答案：B。

【例3】紅細(xì)胞含有大量的血紅蛋白，紅細(xì)胞的機(jī)能主要是由血紅蛋白完成，血紅蛋白的主要功能是攜帶氧氣或二氧化碳，我們可以選用豬、牛、羊或其他脊椎動(dòng)物的血液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，來提取和分離血紅蛋白，請(qǐng)回答下列有關(guān)問題：

(1)實(shí)驗(yàn)前取新鮮的血液，要切記在采血容器中預(yù)先加入檸檬酸鈉，取血回來，馬上進(jìn)行離心，收集血紅蛋白溶液。

①加入檸檬酸鈉的目的是___________。

②以上所述的過程即是樣品處理，它包括__________、_________、收集血紅蛋白溶液。

(2)收集的血紅蛋白溶液在透析袋中可以經(jīng)過透析，這就是樣品的粗分離。

①透析的目的是

②透析的原理是

(3)然后通過凝膠色譜法將樣品進(jìn)一步純化，最后經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定。

①樣品純化的目的是__________。

②血紅蛋白有什么特點(diǎn)?

這一特點(diǎn)對(duì)進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離有什么意義?

思維啟導(dǎo)：檸檬酸鈉是一種抗凝劑，能夠防止血液凝固。凝膠色譜柱中如果產(chǎn)生了氣泡，氣泡就會(huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。

參考答案：

(1)①防止血液凝固

②紅細(xì)胞的洗滌血紅蛋白的釋放

(2)①去除分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)

②透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而大分子則保留在袋內(nèi)

(3)①通過凝膠色譜法將相對(duì)分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去

凝膠色譜法范文第5篇

關(guān)鍵詞：凝膠劑 歐前胡素 高效液相色譜法

中圖分類號(hào)：R286 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-098X（2014）06（a）-0214-02

Determination of Imperatorin in Xiaoyantong Gel

ZHU Yanhua WANG Xinggan GUO Xin YAN Xueying

（Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin，Heilongjiang，150040）

Abstract：Objective：To establish a HPLC method for determination of imperatorin in Xiaoyantong gel.Methods：Mobile phase was methanol-water（55：45）.Detection wavelength：300nm.Flow rate：1.0mL min-1.Column temperature：30℃.Results：The content of imperatorin is determined by this method，while the linear relation was good.The average recovery was 99.53%.The RSD was 1.82%.Conclusions：This method is simple，accurate and can be used for determination of Xiaoyantong gel.

Key words：Gel Imperatorin HPLC

消炎痛凝膠劑是由白芷浸膏、薄荷腦等藥組成。具有消炎止痛的功效，臨床上主要用于治療肌肉痛、關(guān)節(jié)痛、腰腿痛、跌打損傷及網(wǎng)球肘引起的腫痛。為了有效控制消炎痛凝膠劑的質(zhì)量，參考相關(guān)文獻(xiàn)[1-4]采用高效液相色譜法建立了其主要藥味白芷中歐前胡素的含量測(cè)定方法，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確可靠。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（LC-2010 AHT，日本島津公司）；消炎痛凝膠劑（自制，批號(hào)：20130912、20130913、20130914、20130915、20130916）；歐前胡素對(duì)照品（購自中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)： 110826-201013）；甲醇為色譜純；水為超純水；其他所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

色譜柱：（250 nm×4.6 nm，5 ?m）；流動(dòng)相：甲醇-水（55∶45）；檢測(cè)波長：300 nm；流速：1.0 mL?min-1；柱溫：30 ℃；理論塔板數(shù)不得低于2000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取歐前胡素對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含100 ?g的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取凝膠劑約1g，精密稱定，置具塞玻璃試管中，加0.1 mol?L-1鹽酸0.1 mL，用甲醇定容至刻度，超聲30 min，取出后補(bǔ)加甲醇至刻度，用0.45 ?m的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品的溶液。

2.4 陰性溶液的制備

按處方比例稱取除白芷浸膏外的其他藥物，按照供試品溶液的制備方法制備陰性供試品溶液。

2.5 干擾試驗(yàn)

照上述色譜條件，分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液注入色譜儀，記錄色譜圖，歐前胡素對(duì)照品、供試品在9 min左右出現(xiàn)吸收峰，陰性樣品無干擾。

2.6 線性關(guān)系考察

吸取歐前胡素對(duì)照品溶液，加入甲醇制備成濃度分別為0.8、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 μg?mL-1的溶液。分別進(jìn)樣10 ?L，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸處理得回歸方程：A=1.6×105C-14356，R2=0.9995，表明歐前胡素在0.8～16 ?g范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取消炎痛凝膠劑（批號(hào)：20130912）按2.3項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，照上述色譜條件，分別在第0、12、24、36、48、60、72 h進(jìn)樣，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)樣3次，測(cè)得峰面積積分值，RSD為2.2%。結(jié)果表明供試液在72 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 精密度試驗(yàn)

取本品（批號(hào)：20130912）按2.3項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液液10 μL，進(jìn)樣6次，分別記錄峰面積積分值，RSD為1.9%。結(jié)果表明此方法的日內(nèi)精密度良好，符合含量測(cè)定的要求。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取本品（批號(hào)：20130912）按2.3項(xiàng)下供試品溶液的制備方法平行制備6份供試品溶液，照上述色譜條件重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果表明該法測(cè)定歐前胡素含量重復(fù)性良好，RSD為1.57%。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的本品（批號(hào)：20130912）9份，每份約0.1g精密加入歐前胡素對(duì)照品1 mL，濃度分別為12 ?g?mL-1、10 ?g?mL-1、8 ?g?mL-1，每個(gè)濃度三份，按2.3項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，進(jìn)行含量測(cè)定，并計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為99.53%；RSD為1.82%，加樣回收率符合要求，表明該方法準(zhǔn)確。

2.11 樣品的測(cè)定

按2.3項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，取供試品溶液和對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣，測(cè)定5批樣品中異歐前胡素的含量，結(jié)果平均含量為0.1692 mg?g-1，RSD為0.18%（表1）。

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

通過對(duì)乙腈-水，甲醇-水等多個(gè)流動(dòng)相系統(tǒng)，以及甲醇-水的多個(gè)比例進(jìn)行了考察，結(jié)果表明甲醇-水（55∶45）系統(tǒng)作為流動(dòng)相，供試品色譜圖中歐前胡素與其它峰能夠達(dá)到很好的分離。因此選擇該系統(tǒng)作為流動(dòng)相。

3.2 提取溶劑的選擇

試驗(yàn)中曾經(jīng)選用丙酮、乙酸乙酯、甲醇、乙醇進(jìn)行提取，結(jié)果以甲醇提取測(cè)得的含量較高且分離度好，乙醇提取測(cè)得的含量雖高，但有一些雜質(zhì)峰的分離不好，故選用甲醇作為樣品前處理溶劑。

3.3 超聲提取時(shí)間選擇

研究比較了超聲提取10、20、30、40 min，結(jié)果表明超聲30 min歐前胡素提取率高于10、20 min，并與40 min提取率基本相同，故本試驗(yàn)采取了超聲30 min的方法。

參考文獻(xiàn)

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